Agon Hyseni

INLEIDING
Verstoringen in bloedstolling zijn gerelateerd aan een groot aantal ziekten, waaronder hart en vaatziekten, beroerte en trombose. Er bestaat een delicaat evenwicht tussen pro-coagulante en anti-coagulante factoren om bloedingen en trombose of bloedingen te voorkomen. Bloedstollingsfactoren spelen hierin een cruciale rol. Echter, om hun functie uit te voeren, moeten ze eerst worden geactiveerd en hiertoe ondergaan ze een structuursverandering. Te veel activatie kan leiden tot ongewenste verdikking van het bloed, of trombose. Tot dusver was het uiterst moeilijk om te meten hoeveel van deze geactiveerde factoren aanwezig zijn in de circulatie van personen met een hoog risico op trombose. Het doel van dit promotietraject was om geactiveerde stollingsfactoren te bestuderen door middel van het ontwikkelen van specifieke diagnostische testen. Deze testen maken gebruik van enkel-domein antilichamen die worden gegenereerd uit zware-keten (heavy-chain) antilichamen die aanwezig zijn in lama’s (nanobodies). Er zijn verschillende voordelen van nanobodies, zoals een zeer kleine maat, hoge oplosbaarheid, gemakkelijk genetische manipulatie en gemakkelijke productie in bacteriën. Deze testen zullen ons toelaten om allereerst geactiveerde stollingsfactoren te meten en vervolgens te bestuderen wat hun relatie met ziekten zoals een hartaanval en beroerte is.

BEVINDINGEN
In hoofdstukken 3 en 4, bestuderen we Von Willebrand Factor (VWF) en het endotheel in acuut coronair syndroom (ACS) patiënten en patiënten met het systemisch inflammatoir respons syndroom (SIRS). Von Willebrand Factor is een groot multimeer eiwit dat wordt gesecreteerd uit endotheelcellen en speelt een belangrijke rol in bloedplaatjes agglutinatie. In hoofdstuk 3 wordt aangetoond dat ACS-patiënten met een hoog VWF een hoger risico op sterfte hebben op lange termijn. Een interessante waarneming was dat het niveau van VWF-propeptide slechts licht verhoogd was. Het VWF-propeptide wordt tezamen met VWF gesecreteerd door endotheelcellen in een 1:1 ratio, maar de halfwaardetijd van het propeptide in de circulatie is veel korter. Deze eigenschap kan worden gebruikt om te bepalen of er acute of chronische activatie van het endotheel is. De resultaten gepresenteerd in dit hoofdstuk geven aan dat patiënten met een hoog mortaliteitsrisico worden gekenmerken door een chronisch disfunctie van het endotheel. In hoofdstuk 4 wordt aangetoond dat een hoog actief VWF bij patiënten met SIRS is geassocieerd met een verhoogde 28-dagen mortaliteit. SIRS en sepsis patiënten worden gekenmerkt door zeer hoge sterfte, daarom is er een grote klinische noodzaak voor biomarkers die patiënten kan stratificeren of tot een nieuwe therapeutische benaderingen kan leiden. VWF is in dit opzicht een zeer interessante kandidaat. Hoewel het een surrogaat marker is van het endotheel, wanneer actief, is het ook een zeer krachtig trombogeen molecuul. Door gebruik te maken van een speciaal nanobody dat alleen de actieve vorm van VWF herkent, wordt in hoofdstuk 4 aangetoond dat patiënten met een hoger risico op sterfte hebben ook een beduidend hoger niveau van actieve VWF hebben. Opmerkelijk genoeg, was deze associatie onafhankelijk van de meest gebruikte ziekte-ernst score; de APACHE IV (Acute Physiology and Chronic Health Evaluation IV) score. Het is interessant, dat hetzelfde niet werd waargenomen voor de totale VWF niveaus. Hoewel het totale VWF niveaus hoog was in de totale patiëntenpopulatie, was er geen verschil tussen de overlevenden en niet-overlevenden. Dit geeft aan dat de acute secretie van VWF door endotheelcellen een belangrijk diagnostisch kenmerk zou kunnen zijn, maar de waarde ervan op de prognose is beperkt. Omdat VWF wordt gesecreteerd door endotheelcellen in zijn actieve conformatie, lijkt het erop dat factoren die het verwerken cruciaal zijn voor de prognose.

In hoofdstuk 5 wordt een nieuwe kwantitatieve ELISA (Enzyme Linked Immunosorbent Assay) voor de meting van FVIIa (Factor VIIa) beschreven. FVIIa is een eigenaardige stollingsfactor. Samen met Tissue Factor (TF), is het verantwoordelijk voor de initiatie van de stolling. Omdat het afhankelijk is van TF om de stolling te initiëren, is FVIIa ook de enige stollingsfactor die aanwezig is in kleine hoeveelheden in de circulatie in zijn actieve vorm. Tot dusver is de enige manier om FVIIa te meten met een functionele stollingstest die het mogelijk maakt om FVIIa niveaus te schatten. Echter, deze test heeft een aantal nadelen zoals hoge arbeidsintensiviteit en de hoge kosten. Om het onderzoek op FVIIa en zijn rol in trombotische complicaties faciliteren, was er behoefte aan een high-throughput, low-cost kwantitatieve assay. Hiertoe waren specifieke antilichamen die geactiveerd FVIIa herkennen, maar niet FVII zymegen nodig. In dit opzicht zijn nanobodies uitstekende kandidaten. Vanwege hun kleine formaat, kunnen zij de subtiele verschillen tussen FVIIa en FVII onderscheiden. Bovendien zijn ze gemakkelijk en goedkoop te produceren. Verder in hoofdstuk 5, werden FVIIa niveaus geëvalueerd in een cohort studie van SIRS patiënten. De resultaten van deze studie toonden aan dat de relatie tussen FVIIa en het zymogeen FVII belangrijk is met betrekking tot prognose. Patiënten met een hoge FVIIa en lage factor VII hadden een drie keer hoger risico op ziekenhuis mortaliteit in de eerste 60-dagen. Deze resultaten leiden tot een aantal vragen over de mogelijke gunstige effecten van hoge FVIIa niveaus in de circulatie. Een daarvan is dat hoog FVII concurreert met FVIIa voor binding aan beschikbaar TF en daardoor het TF-FVIIa complex blokkeert.

In hoofdstuk 6 wordt een aantal van de mogelijke redenen voor de verschillen tussen de therapeutische efficiëntie van recombinant FVIIa (rFVIIa) en de halfwaardetijd onderzocht. rFVIIa heeft een halfwaardetijd in de circulatie van 2-3 uur. Klinische onderzoeken waarbij rFVIIa profylactisch werd toegediend toonde een 24 uur durend beschermend effect tegen het optreden van bloedingen in hemophilia patienten. In dit studie, zes varkens een bolusdosis van rFVIIa ontvangen en bloed werd genomen tot 48 uur na administratie. Hier wordt aangetoond dat kleine, maar voldoende hoeveelheden FVIIa om hemostase te ondersteunen aanwezig zijn tot 24 uur na administratie van rFVIIa in plasma. Dit is een belangrijk resultaat als het biedt een beweegredenen voor een klinische studie in hemophilia patiënten waarbij kleine hoeveelheden rFVIIa als een profylactisch middel om bloedingen te voorkomen worden geëvalueerd. Verder biedt deze studie het eerste bewijs voor in-vivo opname van rFVIIa door bloedplaatjes.

In hoofdstuk 7 wordt een nieuwe nanobody die de interactie tussen LRP8 (low density lipoprotein receptor-related protein 8) en FXI (Factor XI) remt beschreven. FXI is een interessante anti-trombotische kandidaat aangezien het bekend is dat hoge niveaus zijn geassocieerd met trombose, maar deficiëntie alleen leidt tot milde bloedingen. In veneuze systemen waar coagulatie een belangrijke rol speelt, het is makkelijk om een rol voor FXI te voorstellen. In arteriële systemen is er een hoge shear stress en bloedplaatjes spelen een belangrijke rol bij trombusvorming. Daarom is het mogelijk te veronderstellen dat hier de rol van FXI is gelinkt aan bloedplaatjes. Er zijn twee receptoren voor FXI op bloedplaatjes, glycoproteïne Ib en LRP8. Aangezien FXI een GLA (carboxylation/gamma-carboxyglutamic) domein mist, lokalisatie van FXI aan de bloedplaatjesoppervlak via deze receptoren kan een belangrijke gebeurtenis in trombus opbouw zijn. De handigste manier om deze interactie te bestuderen is door remmende antilichamen die specifiek de FXI-LRP8 interactie remmen. In hoofdstuk 7, hebben we een remmende nanobody die specifiek de LRP8-FXI interactie remt ontwikkeld. Dit nanobody opent tal van mogelijkheden om de relevantie van de LRP8-FXI interactie te bestuderen.