Susanne Van Der Grein

Nederlandse samenvatting voor niet-ingewijden

Extracellulaire vesicles verzorgen communicatie tussen cellen
Communicatie tussen de cellen in ons lichaam is van belang voor het aansturen van verschillende orgaansystemen, waaronder het immuunsysteem dat ons beschermt tegen ziekteverwekkers. Eén van de methoden waarmee cellen met elkaar kunnen communiceren is via het uitwisselen van pakketjes met signaalmoleculen. Deze pakketjes zijn omgeven door een membraan die bestaat uit een dubbele laag lipiden (vetten), en worden daarom ook wel extracellulaire (= buiten de cel) membraanblaasjes, of in het Engels ‘vesicles’, genoemd. Deze extracellulaire vesicles (EV) hebben een diameter van 0.05 – 1 micrometer (cel = 10 – 100 micrometer) en worden uitgescheiden door vrijwel alle celtypes van het lichaam. Daarnaast zijn EV aanwezig in verschillende lichaamsvloeistoffen, waaronder bloedplasma, urine en melk. EV die worden uitgescheiden door de ene cel, kunnen worden opgenomen door een cel die zich dichtbij of op afstand op een andere plaats in het lichaam bevindt. Op deze manier kunnen cellen boodschappen naar elkaar versturen. Deze boodschappen worden gevormd door verschillende typen moleculen waarmee de EV beladen worden, zoals lipiden, eiwitten en RNA, een drager van erfelijk materiaal die lijkt op DNA. In de cel die de EV opgenomen heeft worden de moleculaire boodschappen ‘gelezen’, en kan er, wanneer noodzakelijk, gereageerd worden door middel van aanpassingen aan verschillende cellulaire processen. De functie van EV als cellulair communicatiemiddel is relatief kort geleden ontdekt. Sindsdien wordt bij steeds meer processen die ten grondslag liggen aan ziektes en gezondheid een rol voor EV vastgesteld. Zo kunnen EV bijvoorbeeld verschillende functies uitoefenen tijdens infecties met ziekteverwekkers zoals bacteriën, parasieten, en virussen. Er zijn echter nog veel openstaande vragen over welke rol EV spelen in de communicatie tussen cellen en op welke manier communicatie door middel van EV gereguleerd wordt.

Verschillende factoren dragen bij aan heterogeniteit van EV populaties
De term ‘EV’ wordt gebruikt voor een zeer diverse populatie membraanblaasjes die sterk kunnen variëren in fysieke eigenschappen, zoals grootte en dichtheid. Daarnaast kan de moleculaire samenstelling van EV ver uiteenlopen. Omdat de moleculaire compositie van EV bepaalt welke effecten de EV kunnen hebben in de cellen waarin ze opgenomen worden, leidt de diversiteit in EV inhoud tot een grote variatie aan mogelijke EV functies. De diversiteit in het fenotype (uiterlijk), de moleculaire inhoud, en de functie van EV wordt ook wel omschreven met de term ‘heterogeniteit’. Centraal in dit proefschrift staat het in kaart brengen van de heterogeniteit van EV populaties, de vraag op welke manier de moleculaire inhoud van EV verband houdt met de functie van EV, en de vraag door welke factoren de heterogeniteit veroorzaakt wordt.

Een groot aantal factoren kan bijdragen aan de heterogeniteit van EV populaties. Zo kunnen verschillende celtypen EV uitscheiden met een andere inhoud en functie. De EV die in bloedplasma gevonden worden kunnen bijvoorbeeld uitgescheiden zijn door rode of witte bloedcellen, of door de cellen in de wand van het bloedvat. Naast verschillen tussen EV die door andere celtypen uitgescheiden worden, kan ook binnen de populatie EV die door één enkel celtype wordt uitgescheiden grote verschillen optreden. Dit kan veroorzaakt worden doordat cellen zich kunnen aanpassen aan wisselende omstandigheden uit te omgeving. Een ander zuurstofniveau, variërende beschikbaarheid van voedingsstoffen, en de aanwezigheid van een ziekteverwekker kan ertoe leiden dat een cel een andere ‘activatiestatus’ krijgt. Een geactiveerde cel kan EV uitscheiden met een andere moleculaire samenstelling en functie dan dezelfde cel in rust. Tot slot kunnen ook cellen van één bepaald type, met één bepaalde activatiestatus, verschillende subtypes aan EV produceren. Deze verschillende EV subtypes kunnen via andere routes gevormd worden. De zogenaamde ‘microvesicles’ worden gevormd door uitstulping en afsplitsing van het celmembraan. De zogenaamde ‘exosomen’ worden gevormd in het endosoom, een compartiment binnenin de cel. Deze membraanblaasjes worden afgegeven aan de extracellulaire ruimte wanneer het endosoom fuseert met de celmembraan. Het is met de huidige technieken niet mogelijk om onderscheid te maken tussen deze EV subtypes wanneer ze zich buiten de cel bevinden, en daarom wordt er gebruik gemaakt van de collectieve term ‘EV’ om alle subtypen aan membraanblaasjes aan te duiden.

Recentelijk is er nog een andere route beschreven waarlangs EV gevormd kunnen worden. Bij deze route is ‘autofagie’ betrokken. Autofagie is een proces waarbij een cel interne structuren insluit in een compartiment met een dubbele membraan (het autofagosoom), met als doel deze structuren af te breken om zo de bouwstenen te kunnen hergebruiken. Er werd lange tijd gedacht dat de interne structuren die ingesloten worden in een autofagosoom hoofdzakelijk afgeleverd worden aan het lysosoom, een compartiment in de cel die structuren af kan breken. Er is echter recent ontdekt dat het materiaal dat ingesloten is in autofagosomen ook uitgescheiden kan worden in EV, in een proces wat ‘secretie autofagie’ wordt genoemd.

In dit proefschrift
Verschillende bronnen van heterogeniteit kunnen grote variatie in EV fenotype, samenstelling en functies veroorzaken. In dit proefschrift hebben we op verschillende niveaus de heterogeniteit in EV populaties onderzocht, in twee verschillende biologische systemen. In de eerste plaats hebben we de heterogeniteit van EV populaties onderzocht die wordt veroorzaakt door verschillen in activatiestatus van EV-producerende cellen. Met dit doel hebben we gekeken naar EV die worden uitgescheiden door dendritische cellen (DC), wat zeer belangrijke cellen zijn die het immuunsysteem reguleren. Daarnaast hebben we de heterogeniteit onderzocht binnen een EV populatie die wordt uitgescheiden door één bepaald celtype onder specifieke omstandigheden. Met dit doel hebben we de EV bestudeerd die worden uitgescheiden door cellen die geïnfecteerd zijn met naakte virussen. In beide systemen is inzicht in de complexiteit van EV populaties van essentieel belang om op termijn vragen te kunnen beantwoorden over de functie van EV die door immuuncellen worden uitgescheiden, en over de rol van EV tijdens virusinfecties.

Heterogeniteit in EV populaties uitgescheiden door DC
DC presenteren antigenen (moleculen van ziekteverwekkers) aan T cellen die immuunreacties uitvoeren om de ziekteverwekkers op te ruimen. Door te reageren op signalen uit de omgeving kunnen DC zich ontwikkelen tot cellen die het immuunsysteem activeren, of tot cellen die het immuunsysteem onderdrukken wanneer er geen gevaar is. Deze immuun-onderdrukkende DC worden ook wel tolerogene DC genoemd. Wetenschappers hebben ontdekt dat EV die door immuun-stimulerende DC worden uitgescheiden een rol kunnen spelen in de immuun-activerende werking van deze cellen. Over de functie van EV die uitgescheiden worden door tolerogene DC is veel minder bekend. Kennis over de potentiële immuun-onderdrukkende werking van EV van tolerogene DC zou met name van belang kunnen zijn voor het ontwikkelen van therapieën tegen auto-immuunziekten. Dit zijn aandoeningen waarbij het immuunsysteem overactief is.

In Hoofdstuk 2 van dit proefschrift hebben we onderzocht hoe verschillende immuun-stimuli (immuun-activerende versus immuun-suppressieve) de RNA inhoud van EV die door DC worden uitgescheiden beïnvloedt. Met dit doel hebben we DC gekweekt met LPS (een immuun-activerend bestanddeel van bacteriën) of met Vitamine D3 (VitD3, een stof met een immuun-remmende werking). In deze studie laten we zien dat EV van immuun-activerende LPS-DC andere micro-RNAs (kleine RNAs die genexpressie reguleren) bevatten dan EV van tolerogene VitD3-DC. Vervolgens hebben we in Hoofdstuk 3 onderzocht welke functionele gevolgen deze veranderingen in de RNA compositie van de EV teweeg brengen. Hierbij hebben we gekeken naar het immuun-modulerende effect van EV van tolerogene DC op de communicatie tussen DC en T cellen. We laten zien dat EV van tolerogene DC de afgifte van het inflammatoire cytokine IL-17 door een specifiek type T cel kan remmen. Dit type T cel wordt ‘central memory’ T cel genoemd. Daarbij bespreken we in dit hoofdstuk ook de potentiële link tussen de RNA inhoud van de EV die door tolerogene DC worden uitgescheiden, en hun functie.

Heterogeniteit in EV populaties uitgescheiden door virus-geïnfecteerde cellen
Virussen zijn kleine infectieuze deeltjes die zich alleen kunnen vermenigvuldigen in een ander organisme (de gastheer). Sinds lange tijd wordt er door wetenschappers een tweedeling gemaakt in virussen die wel of niet omgeven zijn door een membraan. Virussen die geen membraan hebben worden ook wel ‘naakte virussen’ genoemd. Dit soort virussen bestaan enkel uit genetisch materiaal (RNA of DNA) wat beschermd wordt door eiwitten. Van dit soort virussen is lang gedacht dat ze alleen uit hun gastheercel kunnen ontsnappen om nieuwe cellen te infecteren door ervoor te zorgen dat de gastheercel kapot gaat. Recent is echter ontdekt dat deze virussen ook uit cellen kunnen ontsnappen die intact blijven. Bij dit proces krijgen ze een membraan mee wat volledig uit materiaal van de gastheercel bestaat. Dit soort deeltjes, waarbij een naakt virus wordt ingesloten in een membraan van de gastheercel, kunnen ook gezien worden als EV die virussen bevatten. De bevinding dat naakte virussen kunnen voorkomen in EV wekte grote interesse, omdat de insluiting in een membraan grote gevolgen heeft voor de manier waarop virus en gastheer met elkaar interacteren. Een belangrijk voordeel voor het virus is bijvoorbeeld dat de membraan ervoor zorgt dat het virus niet door het immuunsysteem van de gastheer herkend kan worden. Op deze manier kan het virus zich als het ware verstoppen en een afweerreactie van de gastheer voorkomen.

Naast dat er EV worden uitgescheiden die virusdeeltjes bevatten, kan virusinfectie ook andere gevolgen hebben voor de afgifte van EV door geïnfecteerde cellen. Zo kan virusinfectie leiden tot grote veranderingen in een cel, waardoor de EV die worden uitgescheiden ook een andere moleculaire samenstelling en functie krijgen. Voor EV uit virus-geïnfecteerde cellen zijn zowel functies beschreven die de infectie bevorderen (pro-virale effecten), als die de infectie tegengaan (antivirale effecten). Welk effect de opname van EV uit virus-geïnfecteerde cellen heeft, wordt bepaald door het type en de moleculaire samenstelling van de EV. Er is echter nog weinig bekend over de heterogeniteit in de compositie van EV die uitgescheiden worden door cellen die geïnfecteerd zijn met naakte virussen. In Hoofdstuk 4 hebben we een uitgebreid review artikel opgenomen waarbij we verschillende aspecten bespreken van heterogeniteit in EV populaties die worden uitgescheiden door cellen die geïnfecteerd zijn met naakte virussen. In dit review artikel bepreken we ook de invloed van celkweek- en virus-gerelateerde experimentele condities, en isolatie en karakterisatie-methodologie, op welk type EV wordt geïsoleerd en welke moleculaire componenten worden gedetecteerd.

De insluiting in EV is met name onderzocht voor naakte virussen van de Picornaviridae familie. Dit is een grote familie aan virussen die diverse humane en veterinaire ziekten kunnen veroorzaken. Tot deze familie behoren o.a. Rhinovirus (wat verkoudheidsverschijnselen veroorzaakt), Poliovirus (poliomyelitis), en Hepatitis A virus (HAV) (hepatitis). In Hoofdstuk 5-7 hebben we experimenteel onderzocht hoe infecties met naakte virussen de heterogeniteit beïnvloeden van EV die uitgescheiden worden door geïnfecteerde cellen. Hierbij hebben we gebruik gemaakt van een modelsysteem waarbij we EV bestudeerd hebben die uitgescheiden worden door cellen die geïnfecteerd zijn met encephalomyocarditis virus (EMCV). Dit is een virus die hoort bij de familie Picornaviridae. In Hoofdstuk 5 hebben we onderzocht of infectie met EMCV leidt tot de afgifte van verschillende typen virus-bevattende en niet-virus bevattende EV tijdens het verloop van een infectie. Om de heterogeniteit van EV populaties goed te kunnen bestuderen zijn technieken nodig die EV kunnen analyseren op het niveau van individuele deeltjes. Om deze reden hebben we o.a. gebruik gemaakt van een speciaal in ons eigen lab ontwikkelde techniek die hoog-resolutie flow-cytometry wordt genoemd. Met deze techniek kunnen we het aantal EV bepalen en daarnaast op het niveau van individuele EV metingen doen aan fysieke eigenschappen zoals licht verstrooiing, en we kunnen met fluorescente markeringen kijken naar welke eiwitten op de buitenkant van EV aanwezig zijn. Daarnaast kunnen we deze techniek ook inzetten om verschillende EV van elkaar te scheiden om deze apart te kunnen bestuderen. In Hoofdstuk 5 laten we zien dat er inderdaad heterogeniteit bestaat in de EV populatie die uitgescheiden wordt door cellen die geïnfecteerd zijn met EMCV. De EV die door deze virus-geïnfecteerde cellen worden uitgescheiden verschillen in grootte, in de mate van licht verstrooiing, in moleculaire samenstelling en in functie. Door verschillende EV populaties van elkaar te scheiden laten we zien dat sommige EV beter virus infecties kunnen doorgeven aan nieuwe gastheercellen dan andere EV.

In Hoofdstuk 6 hebben we vervolgens gekeken of the verschillende typen EV die door virus-geïnfecteerde cellen worden afgegeven ook via een andere route gevormd worden. De observatie dat het bij autofagie betrokken eiwit LC3 aanwezig is in de populatie EV die door virus-geïnfecteerde cellen wordt uitgescheiden bracht ons op het spoor van de mogelijke betrokkenheid van secretie autofagie. In Hoofdstuk 6 laten we zien dat secretie autofagie een belangrijke rol speelt bij de vorming en afgifte van virus-bevattende EV. Daarnaast laten we zien dat een viraal eiwit, de Leader genaamd, een belangrijke rol speelt bij het tot stand komen van secretie autofagie. De Leader is een eiwit die belangrijk is voor infectie in levende organismen met een functioneel afweersysteem. De Leader belemmert namelijk antivirale verdedigingsmechanismen van de gastheercellen. Wij laten zien dat de Leader de gebruikelijke autofagie route richting afbraak onderdrukt en de secretie-route stimuleert om ervoor te zorgen dat virussen in EV uitgescheiden worden. De Leader is een bepalende factor in het aantal, type en de moleculaire samenstelling van EV afkomstig van virus-geïnfecteerde cellen.

Analyse van de moleculaire samenstelling van EV afkomstig van virus-geïnfecteerde cellen kan aanwijzingen opleveren over de pro- of antivirale rol van deze EV. Om deze reden hebben we in Hoofdstuk 7 een uitgebreide analyse gedaan van de eiwitsamenstelling van EV afkomstig van cellen geïnfecteerd met EMCV met behulp van een techniek die ‘proteomics’ wordt genoemd. Met deze techniek hebben we vergeleken welke eiwitten terecht komen in EV die uitgescheiden worden door geïnfecteerde en niet-geïnfecteerde cellen. Daarnaast hebben we ook gekeken naar de rol van de Leader in het bepalen van de eiwitsamenstelling van EV met behulp van een mutant virus die een defect Leader eiwit heeft. Deze analyse leverde een flink aantal aanwijzingen op dat secretie autofagie een rol speelt bij de vorming van EV uit virus-geïnfecteerde cellen. Daarnaast bleek uit de proteomics analyse ook dat zowel het virus als de antivirale verdedigingsmechanismen van de gastheercel de incorporatie van bepaalde eiwitten in EV kunnen aansturen. Op grond van deze resultaten hebben we in Hoofdstuk 7 hypotheses opgesteld over de mogelijke formatie en afgifte route van EV uit EMCV-geïnfecteerde cellen en over de pro- en antivirale functies van deze EV.

Heterogeniteit in virus-bevattende EV populaties in bloedplasma
Voor de meeste naakte virussen is hun insluiting in EV aangetoond met celkweek experimenten. Voor HAV en Hepatitis E virus (HEV), een virus die tot de Hepeviridae familie behoort, zijn virus deeltjes in EV ook in de bloedbaan van geïnfecteerde patiënten gevonden. HEV is net als HAV een virus wat vermenigvuldigt in de lever en hepatitis kan veroorzaken. Er is in Westerse landen in recente jaren een hernieuwde opkomst geweest van HEV infecties die overgedragen worden van dier op mens (zoönotische infecties). Het bestuderen van virus deeltjes in EV uit bloed van geïnfecteerde personen wordt bemoeilijkt door de complexe samenstelling van deze lichaamsvloeistof. Naast EV bevinden zich in bloed ook veel andere componenten, zoals eiwitcomplexen en lipoproteïne deeltjes (zoals LDL en HDL; dragers van cholesterol in bloed), die qua fysieke eigenschappen veel overeenkomsten hebben met EV. Hierdoor is het moeilijk om EV van dit soort deeltjes te onderscheiden. In Hoofdstuk 8 hebben we, door gebruik te maken van verschillende technieken om EV van andere componenten in bloedplasma te onderscheiden, onderzocht of HEV voorkomt in verschillende EV populaties in de bloedbaan van geïnfecteerde patiënten. De preliminaire resultaten in dit hoofdstuk laten zien dat HEV inderdaad in verschillende typen EV voorkomt.

Conclusie
Onze bevindingen ondersteunen de hypothese dat de heterogeniteit in moleculaire samenstelling van EV samenhangt met de verscheidenheid aan functies van EV. Deze data benadrukken het belang om de samenstelling van EV populaties goed in kaart te brengen alvorens de functie van EV bestudeerd kan worden.