Aram Van Brussel

Hoewel de relatieve borstkankersterfte aanzienlijk is gedaald in de afgelopen decennia, is door een toename van het aantal borstkankerpatiënten het absolute aantal mensen wat aan deze ziekte overlijdt in Nederland stabiel gebleven. Uitzaaiingen zijn de oorzaak van de meeste kanker-gerelateerde sterfgevallen. Vroegdetectie en het chirurgisch verwijderen van tumoren die nog niet zijn uitgezaaid, zouden daarom de sterfte kunnen verminderen. Hiervoor zijn gevoelige beeldvormende technieken nodig die gebruikt kunnen worden voor het bevolkingsonderzoek en tijdens operaties. Helaas hebben de huidige beeldvormende technieken een beperkte specificiteit voor borstkanker, maken ze gebruik van ioniserende straling en/of zijn ze kostbaar.

Moleculaire beeldvorming, nucleair versus optisch

Traditionele beeldvormende technieken, zoals ‘magnetic resonance imaging’ (MRI), computer tomografie (CT) en echografie, maken gebruik van fysische en fysiologische eigenschappen voor contrastvorming en karakterisering van tumoren. Moleculaire beeldvorming is gebaseerd op deze technieken maar gebruikt, in plaats van (niet tumor-specifieke) fysische eigenschappen, specifieke moleculaire eigenschappen van tumoren (tumormarkers) voor het verkrijgen van contrast. Moleculaire beeldvorming is op te delen in twee soorten: nucleaire en optische moleculaire beeldvorming. Bij nucleaire moleculaire beeldvorming worden tumormarkers specifiek gebonden door agentia, zoals antilichamen of kleine moleculen (‘small molecules’), die gelabeld zijn met radioactieve isotopen. Opname van deze agentia in de tumor wordt vervolgens gemeten door middel van positron emissie tomografie (PET) of ‘single-photon emission computed tomography’ (SPECT). Nucleaire beeldvorming is sensitief en heeft een grote penetratiediepte (wat belangrijk is voor detectie van diep liggende tumoren), echter de resolutie is beperkt, wat een probleem kan opleveren bij tumorkarakterisering en het plannen van de therapie. Andere nadelen zijn hoge kosten voor het produceren van de isotopen, ingewikkelde logistieke infrastructuur en de beschermende maatregelen die nodig zijn tegen de ioniserende straling.
Bij optische moleculaire beeldvorming wordt gebruik gemaakt van licht in plaats van ioniserende straling. Bovendien is de benodigde apparatuur minder duur en heeft deze techniek een hoge resolutie. Echter, een beperkte penetratiediepte is een belangrijk probleem wat opgelost moet worden voordat deze techniek een plaats kan krijgen in de kliniek. Dit probleem kan deels opgelost worden door gebruik te maken van nabij-infrarood licht (NIR, 700-900 nm) wat het deel van het spectrum is tussen rood en infrarood. Deze golflengte wordt het minst geabsorbeerd door levend weefsel waardoor een optimale penetratiediepte verkregen kan worden.

Optische agentia, tumor gericht (‘targeted’) versus niet tumor gericht (‘non-targeted’)

In een eerder gepubliceerde studie leidde moleculaire beeldvorming met het aspecifieke NIR contrastmiddel Omocianine bij patiënten tot een beperkt signaal van de borsttumoren ten opzichte van omliggend weefsel. Dit suggereert dat tumor gerichte (‘targeted’) agentia nodig zijn om tumoren optimaal te kunnen detecteren. De ideale tumormarker waartegen deze stoffen gericht zouden moeten zijn, zou in 100% van de tumoren moeten worden geproduceerd (‘geëxpresseerd’) en niet aanwezig moeten zijn in normaal weefsel of in goedaardige tumoren. Expressie niveaus van veel bekende tumormarkers (zoals groeifactor receptoren) zijn in tumor en normaal borstweefsel van patiënten gemeten, maar ofwel de specificiteit voor tumorweefsel ofwel de expressie niveaus zijn beperkt. Tumormarkers die in tumoren met zuurstof tekort (hypoxie) tot expressie komen zijn interessante kandidaten. Hypoxie komt veel voor in tumoren en niet of nauwelijks in gezond (borst)weefsel en wordt veroorzaakt door snelle tumorgroei in combinatie met een inefficiënte doorbloeding. In hypoxische (zuurstof-arme) tumor cellen zorgt ‘hypoxia-inducible factor 1a’ (HIF-1a) voor transcriptie van verschillende tumormarkers. In hoofdstuk 2 voerden wij een meta-analyse uit van in de literatuur gerapporteerde expressie niveaus van vier hypoxie-gerelateerde tumormarkers in normaal borstweefsel, goedaardige tumoren en borstkanker: carboxyl anhydrase IX (CAIX), glucose transporter 1 (GLUT1), C-X-C chemokine receptor type-4 (CXCR4) en ‘insulin-like growth factor-1 receptor’ (IGF-1R). GLUT1 had het hoogste expressie niveau in tumoren: 44%. Echter, geen van deze markers kwam vaak genoeg in tumoren tot expressie voor gebruik als individuele tumor marker. Daarom zochten wij in hoofdstuk 3 naar het minimale aantal gecombineerde tumormarkers om het grootste gedeelte van alle kwaadaardige borsttumoren te kunnen detecteren. Ook keken wij naar het vermogen om met behulp van deze markers te kunnen discrimineren tussen normaal en kwaadaardig borstweefsel. We lieten zien dat van een combinatie van markers (CD44v6, GLUT1 (of CAIX), EGFR, HER2 en IGF-1R) er minstens één tot expressie komt in 80% van alle humane borstkankers, wat ze geschikt maakt om te worden getest als tumormarkers voor moleculaire beeldvorming. Omdat we met deze optimale combinatie nog steeds 20% van de borstkankers missen, zochten we in hoofdstuk 4 naar nieuwe tumormarkers die tot expressie komen in hypoxische weefsels. Hiervoor maakten we gebruik van een aangepaste ‘phage-display’ technologie. We beschreven de selectie van nanobodies die specifiek zijn voor hypoxische weefsels. Uit data van massaspectrometrie en bindingsproeven bleek dat nanobody A2ANN de hypoxie-gerelateerde tumormarker DAF bond. We hebben DAF ook als tumormarker getest in ons muismodel. De tumorsignalen van muizen die ingespoten waren met het DAF-specifieke nanobody waren significant hoger vergeleken met de tumorsignalen van muizen die waren ingespoten met het controle nanobody.

Moleculair gewicht van tumor gerichte (‘targeted’) agentia

Een reeks stoffen met verschillende moleculaire massa’s, zoals IgG antilichamen, antilichaam-fragmenten (zoals nanobodies), ‘small molecules’ en nanodeeltjes, zijn voorheen door anderen preklinisch en klinisch getest voor moleculaire beeldvorming. Nanobodies zijn kleine gerichte (‘targeted’) agentia die afgeleid zijn van het variabele domein van ‘heavy chain-only’ antilichamen (VHH) die van nature voorkomen in kameelachtigen. In dit proefschrift testten wij de ‘small molecules’, nanobodies en IgG antilichamen als tumor-specifieke agentia voor optische moleculaire beeldvorming van hypoxische borstkanker. In hoofdstuk 5 beschrijven we de synthese van ‘small molecule’ 2-nitroimidazol en de conjugatie met de nabij-infrarode stof IRDye800CW (resulterend in het conjugaat ‘2-nitro-IR’) voor detectie van borstkanker. Specificiteit voor hypoxische cellen was met behulp van een celkweek experiment bevestigd. Evaluatie in een muismodel voor borstkanker, toonde aan dat zowel tumor- als achtergrondsignalen van 2-nitro-IR hoger waren dan bij controle muizen, wat resulteerde in matig contrast. Chemische modificatie (meer dan één fluorofoor per 2-nitroimidazol molecuul of meer dan één 2-nitroimidazol molecuul per fluorofoor) zou het fluorescente signaal kunnen versterken in toekomstige studies. Gebaseerd op onze huidige resultaten concluderen wij dat op antilichaam gebaseerde moleculen, in plaats van ‘small molecules’, nodig zijn voor een succesvolle detectie van hypoxische tumoren. Van oudsher worden voornamelijk IgG monoclonale antilichamen (met een moleculair gewicht van 150 kDa) gebruikt voor dergelijke toepassingen. In hoofdstuk 6 onderzochten wij moleculaire beeldvorming van borstkanker met een NIR fluorescent antilichaam gericht tegen CAIX (MabCAIX-IR) in een muis model. We lieten zien dat 24 uur na injectie van MabCAIX-IR, hypoxische borstkankertumoren succesvol kunnen worden gedetetecteerd vóór en tijdens chirurgie. Deze techniek kan het wegsnijden van de complete tumor tijdens chirurgie vergemakkelijken. Met behulp van gevoelige fluorescentie scans van het tumorweefsel toonden wij, 96 uur na injectie, CAIX expressie aan rondom necrotische gebieden in de tumor, wat de specificiteit van MabCAIX-IR voor CAIX bevestigde. Verder suggereerden wij dat deze beeldvormende techniek ook gebruikt zou kunnen worden voor optimale fluorescentie-gestuurde weefsel preparatie op de pathologie afdeling.
In hoofdstuk 7 labelden we CD44v6-specifieke antilichamen met IRDye800CW en evalueerden tumor- en weefselopname in muizen met getransplanteerde CD44v6-positieve en -negatieve tumoren. Net zoals bij MabCAIX-IR werden optimale fluorescente signalen van dit antilichaam vanuit de tumoren vastgesteld vanaf 24 uur na injectie. We concluderen hieruit dat het gebruik van antilichamen als tumor gerichte moleculen voor optische moleculaire beeldvorming, door de langzame tumorpenetratie en renale klaring, resulteert in hoge achtergrond signalen en dus laag contrast gedurende de eerste 24 uur na injectie. Vanaf 24 uur tot wel enkele weken na injectie kunnen antilichamen een optimaal tumorsignaal afgeven. Om hoog contrast te verkrijgen gedurende de eerste dag na injectie, zijn tumor-specifieke moleculen nodig die snel in de tumor accumuleren. Aangezien grootte en affiniteit (bindingskracht) van invloed zijn op de tumorbinding van de meeste macromoleculen (grote moleculen), hebben kleinere moleculen een hoge affiniteit nodig om snelle uitwassing uit de tumor te voorkomen. In hoofdstuk 8 beschrijven we de ontwikkeling en toepassing van nieuwe CAIX-specifieke nanobodies die een snellere tumoropname hebben dan conventionele antilichamen en gebruikt kunnen worden voor snelle moleculaire beeldvorming van borstkanker. We selecteerden hoge affiniteit CAIX-specifieke nanobodies met een aangepaste phage display technologie en conjugeerden deze nanobodies aan IRDye800CW. Al na 2 uur werden relatief sterke tumorsignalen geobserveerd. We testten nanobody B9-IR in muizen en reeds 2 uur na injectie konden we hypoxische borsttumoren detecteren, zowel vóór als tijdens chirurgie. Net zoals bij MabCAIX-IR liet de stabiliteit van B9-IR toe dat CAIX eiwit zichtbaar gemaakt kon worden in plakjes tumorweefsel (moleculaire fluorescentie pathologie), wat resulteerde in sterkere signalen dan bij conventionele CAIX-immunohistochemische kleuring op de pathologie afdeling. Tot slot evalueren we in hoofdstuk 9 een cocktail van HER2- en CAIX-specifieke nanobodies voor dual-spectrale optische moleculaire beeldvorming van borstkankertumoren in muizen. We bepalen tegelijkertijd de expressie status van CAIX en HER2 in MCF10DCIS tumoren. In de toekomst kan het gebruik van nanobody cocktails voor moleculaire beeldvorming de detectie van tumoren, de afgrenzing van tumor weefsel tijdens chirurgie en de tumor karakterisering op de pathologie afdeling, optimaliseren.