Lisanne De Vor

Introductie

Infecties met stafylokokken zijn moeilijk te behandelen. Op onze huid leven miljarden bacteriën, waaronder bacteriën van het soort stafylokokken. Wanneer stafylokokken, met name Staphylococcus aureus, onze eerste verdedigingslinie (de huid) doorbreken, kunnen ze verschillende ziektes veroorzaken, zoals huidinfecties, longontsteking, ontsteking van het hart, botinfectie en bloedvergiftiging. Normaal gesproken worden dit soort infecties behandeld met antibiotica, maar door het ontstaan van antibioticaresistente stafylokokken zoals de MRSA-bacterie (ook wel bekend als ‘ziekenhuisbacterie’), wordt behandeling met antibiotica steeds moeilijker. Er zijn nog maar een paar antibioticasoorten beschikbaar als laatste redmiddel om infecties met resistente bacteriën te behandelen.

Naast antibioticaresistentie zijn stafylokokken (Staphylococcus aureus en Staphylococcus epidermidis) berucht vanwege hun vermogen om biofilm te vormen op weefsel zoals in longen en chronische wonden, en op medische implantaten, zoals orthopedische implantaten en hartkleppen (figuur 1). In een biofilm worden de stafylokokken omgeven door een zelfgeproduceerd netwerk van suikers, eiwitten en DNA. Dit netwerk zorgt ervoor dat de bacteriën tolerant zijn voor behandeling met antibiotica en slechter door het lichaamseigen immuunsysteem kunnen worden opgeruimd. Wanneer een bacterie loskomt uit de biofilm kan dit resulteren in verspreiding van de infectie. Door het toenemende gebruik van medische implantaten is biofilmvorming een groeiend probleem. Op dit moment is 25% van de infecties die worden opgelopen in het ziekenhuis gerelateerd aan medische implantaten.

Omdat infecties met stafylokokken extreem slecht te behandelen zijn met de huidige therapieën, is het nodig om alternatieve behandelmethoden te ontwikkelen. In dit proefschrift hebben we meer inzicht proberen te krijgen in het gebruik van antistoftherapie tegen infecties met stafylokokken.

Figuur 1. Schematische weergave van een biofilm. Stafylokokken zijn berucht vanwege hun vermogen om biofilm te vormen op medische implantaten. In een biofilm worden bacteriën omgeven door een zelfgeproduceerd netwerk van suikers, eiwitten en DNA. Dit netwerk zorgt ervoor dat de bacteriën tolerant zijn voor behandeling met antibiotica en slechter door het lichaamseigen immuunsysteem kunnen worden opgeruimd. Wanneer een bacterie loskomt uit de biofilm kan dit resulteren in verspreiding van de infectie.

Antistoffen spelen een centrale rol in de immuunreactie tegen stafylokokken. Antistoffen zijn eiwitten die in ons lichaam geproduceerd worden door een type immuuncellen, de B-cellen, als reactie op lichaamsvreemde deeltjes zoals bacteriën. Elke B-cel produceert een uniek antistof (een monoklonaal antistof), gericht tegen een uniek lichaamsvreemd deeltje. Antistoffen zijn in grote hoeveelheden aanwezig in ons bloed en kunnen zeer specifiek bacteriën herkennen. Antistoffen (figuur 2) zijn Y-vormige eiwitten met twee armen (Fab-armen) die een lichaamsvreemde structuur kunnen binden. De staart van de Y-vorm wordt het Fc-domein genoemd en kan met het immuunsysteem reageren. Na binding aan het bacteriële celoppervlak via de Fab-armen zetten antistoffen een reactie in gang (figuur 3). De reactie wordt gevormd door complementeiwitten (C-eiwitten), een groep eiwitten in het bloed die elkaar als een kettingreactie kan activeren. Een belangrijk resultaat is de productie van C3b-eiwitten. Deze eiwitten hechten zich massaal aan het oppervlak van de bacterie en markeren de bacterie als indringer. Immuuncellen kunnen antistoffen en C3b-eiwitten op de bacterie herkennen met Fc-receptoren en complementreceptoren en worden zo gestimuleerd om de bacterie aan te vallen.

Figuur 2. Schematische weergave van de structuur van een antistof. Antistoffen zijn Y-vormige eiwitten met twee armen (Fab-armen) die een lichaamsvreemde structuur kunnen binden. De staart van de Y-vorm wordt het Fc-domein genoemd en kan met het immuunsysteem reageren.

De belangrijkste immuuncel die stafylokokken kan elimineren is de neutrofiel. Dit is de meest voorkomende witte bloedcel, die bacteriën onschadelijk kan maken door ze op te nemen. Na opname wordt de bacterie gedood in celcompartimenten die gevuld zijn met enzymen, antimicrobiële eiwitten en reactieve zuurstofverbindingen. Dit proces heet fagocytose, van het Griekse phagein: eten/verslinden. Het markeren van bacteriën door antistoffen en complementeiwitten heet opsonisatie. Deze term komt van het Griekse “opson” dat specerij betekent. Op eenzelfde manier als specerijen maken antistoffen en complement het opeten van bacteriën makkelijker voor neutrofielen.

Figuur 3. Immuunrespons tegen stafylokokken. Wanneer een bacterie ons lichaam binnendringt, stimuleert het afweersysteem B-cellen om natuurlijke antistoffen tegen de bacterie aan te maken. Deze antistoffen kunnen het bacteriële celoppervlak herkennen en binden. Vervolgens zetten de gebonden antistoffen een kettingreactie, de complementcascade, in gang. Deze kettingreactie leidt tot de productie van C3b-eiwitten die zich massaal aan het bacteriële oppervlak hechten. Immuuncellen genaamd neutrofielen kunnen de bacterie herkennen met Fc-receptoren (die antistoffen herkennen) en complementreceptoren (die C3b-eiwitten herkennen). Dit stimuleert neutrofielen om de bacterie op te nemen (fagocytose). Na fagocytose wordt de bacterie gedood in celcompartimenten die gevuld zijn met antimicrobiële stoffen. Wanneer ons afweersysteem er niet goed in slaagt om een bacteriële infectie te elimineren, kunnen therapeutische antistoffen wellicht worden ingezet om fagocytose te stimuleren.

Ontwikkeling van antistoftherapie

In de afgelopen jaren is het mogelijk geworden om monoklonale antistoffen te identificeren uit B-cellen. Vervolgens kunnen deze antistoffen in grote hoeveelheden in het lab geproduceerd worden, en veilig toegediend worden aan patiënten. Ook is het mogelijk om monoklonale antistoffen in het lab te modificeren om zo de functie te versterken. Hierdoor is de interesse in antistoftherapie de laatste jaren toegenomen. De meeste antistoftherapieën worden gebruikt voor de behandeling van kanker of auto-immuunziekten, maar over het gebruik van antistoftherapie voor infectieziekten is nog weinig bekend. Omdat antistoffen een centrale rol spelen in de immuunrespons tegen stafylokokken, zou antistoftherapie bijvoorbeeld ook toegediend kunnen worden wanneer het immuunsysteem er niet in slaagt deze bacteriën te vernietigen. Voor bacteriën die biofilm hebben gevormd, is het nog niet duidelijk hoe de immuunrespons precies verloopt. Waarschijnlijk is hier een andere aanpak nodig, en moeten bacteriën eerst losgemaakt worden uit het beschermlaagje van de biofilm. Antistoffen zouden in het geval van biofilmvorming bijvoorbeeld gekoppeld kunnen worden aan enzymen die het beschermlaagje wegknippen en de bacteriën zo beschikbaar maken voor fagocytose. De functie van antistoffen is dan om de enzymen specifiek naar de plek van de infectie te brengen.

Bevindingen

Allereerst probeerden we monoklonale antistoffen te identificeren die stafylokokken kunnen herkennen wanneer ze in een biofilm groeien. Biofilm is een erg complexe structuur en het biofilm-netwerk kan bestaan uit verschillende componenten (suikers, eiwitten en DNA) in verschillende verhoudingen. Aan het begin van deze studie was er maar één monoklonaal antistof geïdentificeerd dat biofilm van stafylokokken kon herkennen, en dus gebruikt kon worden voor antistoftherapie tegen Staphylococcus biofilm. Echter, dit antistof herkent een suiker dat maar door 30% van de klinische stammen wordt gebruikt. Omdat de gedeelde factor in alle Staphylococcus biofilm-infecties de bacterie zelf is, hebben we in hoofdstuk 2 onderzocht of antistoffen die structuren op het oppervlak van de bacterie herkennen dit ook nog kunnen wanneer de bacterie bedekt is met biofilm-componenten. In totaal vonden we vier monoklonale antistoffen die stafylokokken in biofilm konden binden. Ook bonden deze stoffen de biofilm gevormd door alle klinische stammen die we getest hebben. Vervolgens hebben we één monoklonaal antistof gekozen en in een muismodel aangetoond dat dit antistof na injectie in de bloedbaan kan lokaliseren naar een implantaat met biofilm. Deze antistoffen kunnen dus wellicht worden gebruikt om antistoftherapie tegen biofilm-infecties te ontwikkelen.

Wanneer een stafylokok loskomt uit een biofilm, wordt ze weer gevoelig voor antibiotica en immuuncellen. Daarom wordt er veel onderzoek gedaan naar het gebruik van enzymen die het netwerk van DNA, eiwitten of suikers kapot kunnen knippen. Dit soort enzymen (DNase; knipt DNA, en DispersinB; knipt suikers), zijn veelbelovend tegen biofilmvorming op makkelijk bereikbare plekken zoals chronische wonden of de longen. Echter, het gebruik voor infecties op minder bereikbare plekken is gecompliceerd, omdat de enzymen niet op de plek van infectie terechtkomen. In de behandeling van kanker worden antilichaam-drug-conjugaten ingezet om toxische stoffen af te leveren in de tumor. In hoofdstuk 3 beschrijven we een manier om monoklonale antistoffen aan DNase of Dispersin te koppelen. De resulterende fusie-eiwitten behouden hun specificiteit voor de stafylokok en zijn enzymatisch actief in het losmaken van stafylokokken uit biofilm. Dit soort antistof-enzym conjugaten kunnen veelbelovend zijn in het gebruik tegen biofilm-gerelateerde Staphylococcus infecties.

In hoofdstuk 4 vergelijken we het gebruik van monoklonale antistoffen als alternatief voor Intraveneus Immunoglobulin (IVIG), de standaardtherapie bij infectie met S. epidermidis bij vroeggeboren baby’s (neonaten). Neonaten hebben een verhoogd risico op deze infectie door hun onderontwikkelde immuunsysteem. IVIG is een mix van antistoffen geïsoleerd uit het bloed van gezonde donoren, die gericht zijn tegen verschillende lichaamsvreemde structuren, waaronder S. epidermidis. In tegenstelling tot IVIG herkennen monoklonale antistoffen éénzelfde lichaamsvreemde structuur en ze zijn daarom veel specifieker. In dit onderzoek observeerden we dat activatie van het complementsysteem essentieel was voor het fagocyteren en elimineren van S. epidermidis. Vervolgens hebben we de Fc-staart van de monoklonale antistoffen gemuteerd (een wijziging in de bouwstenen van het antistof) met een mutatiestrategie die ervoor zorgt dat de complementcascade beter in gang kan worden gezet. Hiermee kon de eliminatie van S. epidermidis nog verder worden verhoogd. Ook toonden we aan dat deze ‘verbeterde’ monoklonale antistoffen ook met het neonatale complementsysteem reageren en zo fagocytose kunnen stimuleren.

In hoofdstuk 5 beschrijven we een dubbele rol van het complementsysteem in het sturen van fagocytose via Fc-receptoren en complementreceptoren. Op een geopsoniseerde bacterie zijn antistoffen en C3b aanwezig, die respectievelijk herkend kunnen worden door Fc-receptoren en complementreceptoren. In hoofdstuk 5 observeren we dat na de depositie van complementeiwitten, de herkenning van antistoffen door Fc-receptoren geblokkeerd wordt. De manier waarop een bacterie wordt opgenomen (via Fc-receptoren of complementreceptoren) kan invloed hebben op het elimineren van de bacterie. Deze nieuwe inzichten in de dubbele rol van complement na activatie door antistoffen kan belangrijk zijn in het ontwikkelen van nieuwe antistoftherapieën.

Als laatste zijn in hoofdstuk 6 alle bevindingen van dit proefschrift samengevat en in de context van het onderzoeksveld geplaatst. We bespreken wat we hebben geleerd en hoe onze bevindingen kunnen bijdragen aan de ontwikkeling van therapeutische antistoffen tegen infecties met stafylokokken.

Ter conclusie

Door het onderzoek in dit proefschrift begrijpen we beter hoe antistoffen via het complementsysteem fagocytose van stafylokokken kunnen stimuleren. Ook hebben we meer inzicht gekregen in het gebruik van monoklonale antistoffen tegen biofilm-infecties. De bevindingen beschreven in dit proefschrift kunnen bijdragen aan de ontwikkeling van antistoftherapie tegen stafylokokkeninfecties.