Arina Buizer

De stappen die genomen zijn om de toepassing van zuurstof afgevende microbolletjes voor het verbeteren van de regeneratie van bot te vertalen van laboratoriumtafel naar in vivo toepassing worden in dit proefschrift beschreven.

Op dit moment is de gouden standaard voor het repareren van botdefecten het gebruik van autoloog bot. De belangrijkste nadelen van het gebruik van autoloog bot zijn het vóórkomen van morbiditeit ter plaatse van de oogstlocatie van het bot, het feit dat er een extra ingreep nodig is (met de bijkomende kosten) voor het oogsten van een bottransplantaat en de beperkte beschikbaarheid van autologe bottransplantaten. Daarom worden de mogelijkheden voor het regenereren van botweefsel steeds meer onderzocht. Met name wordt veel onderzoek gedaan naar botregeneratie middels een scaffold die ingezaaid wordt met cellen die het vermogen hebben botweefsel te vormen. Menselijke mesenchymale stamcellen (hMSC) hebben het vermogen bot te vormen, ze zijn gemakkelijk te verkrijgen en ze hebben trofische effecten. hMSCs zijn door deze eigenschappen een gewild celtype om op scaffolds voor botregeneratie te zaaien. De vascularisatie van scaffolds die ingezaaid zijn met cellen blijft nog een belangrijk punt. Op het moment dat een scaffold in het lichaam geïmplanteerd wordt, worden de cellen die op de scaffold gezaaid zijn blootgesteld aan langdurige ischemische omstandigheden, omdat ze vaak geïmplanteerd worden op loci met verstoorde vascularisatie en omdat er in een scaffold geen vascularisatie aanwezig is. Vooral de cellen die zich in het centrum van de scaffold bevinden krijgen niet voldoende zuurstof om te overleven, waardoor de kwaliteit van de botregeneratie maar matig is. Wanneer hMSCs worden blootgesteld aan ischemie, gaan ze angiogene groeifactoren (AGF) produceren. Die AGF stimuleren de ingroei van bloedvaten. Door de opbouw van een vasculair netwerk in een scaffold ingezaaid met cellen wordt een duurzame zuurstofvoorziening opgezet. Door de aanwezigheid van zo’n duurzame zuurstofvoorziening kunnen hogere aantallen cellen die op een scaffold gezaaid zijn overleven, en zo kan een optimale botregeneratie bereikt kunnen worden. Er zijn microbolletjes die geleidelijk aan zuurstof afgeven ontwikkeld, ten eerste om de overleving van hMSCs in de eerste weken na implantatie in het lichaam te verhogen. Ten tweede, door maar een klein beetje zuurstof af te geven wordt de productie van AGF door hMSCs gestimuleerd, waarmee het opbouwen van een duurzame zuurstofvoorziening op de langere termijn wordt ondersteund. De zuurstof afgevende microbolletjes worden gemaakt met poly (trimethylene carbonate) (PTMC) als matrixmateriaal en calcium peroxide partikels (CaO2) als zuurstofdonor. CaO2 reageert met water volgens onderstaande chemische reacties, resulterend in de productie van zuurstof.

CaO2 + 2 H2O → Ca(OH)2 + H2O2
2 H2O2 → O2 + 2 H2O

PTMC wordt afgebroken middels een oppervlakte erosie-proces, wat inhoudt dat de CaO2 partikels die door de PTMC matrix verspreid zijn geleidelijk aan aan water blootgesteld worden. Op deze manier is een systeem dat geleidelijk aan zuurstof afgeeft gecreëerd.

De doelen van dit proefschrift zijn:

• Onderzoeken welke methode het meest geschikt is voor het zaaien van cellen op biomaterialen met hoge en met lage porositeit;
• Onderzoeken bij welk zuurstofpercentage hMSCs zich het beste prolifereren en tegelijkertijd AGF produceren;
• Het ontwikkelen van een methode om PTMC-CaO2 microbolletjes te produceren en te onderzoeken hoe het zuurstof afgifteprofiel van deze microbolletjes is;
• Kijken of de zuurstof afgevende microbolletjes biocompatibel zijn in vitro en in vivo;
• Onderzoeken of de toepassing van zuurstof afgevende microbolletjes de overleving van ischemisch weefsel verbetert in vivo.

In Hoofdstuk 2 wordt een statische en een vacuümmethode voor het zaaien van hMSC op een scaffold met lage en een scaffold met hoge porositeit vergeleken. Drie verschillende celzaaidichtheden worden vergeleken voor het gebruik op een scaffold met hoge porositeit. De levensvatbaarheid van de cellen, de celproliferatie en de celzaaihomogeniteit zijn de eindpunten in deze studie. hMSCs werden geïsoleerd uit het beenmerg dat vrijkwam bij het opraspen van de femurschacht bij het plaatsen van een totale heuparthroplastiek. De cellen die op deze manier verkregen zijn, zijn gebruikt bij alle hMSC-experimenten die in dit proefschrift beschreven zijn. De cellen zijn gekarakteriseerd volgens de richtlijnen die opgesteld zijn door de International Society for Cellular Therapy (ISCT) en het celprofiel voldeed aan de ISCT richtlijnen. Ongeacht welke celzaaimethode gebruikt werd, zowel in scaffolds met hoge als met lage porositeit, was er een hogere celadherentie aan de buitenkant van de scaffold dan aan de binnenkant. Bij scaffolds met een lage porositeit resulteerde de vacuüm celzaaimethode in de meest homogene celzaaiing en het hogere aantallen adherente cellen aan de scaffold dan de statische celzaaimethode. Op de scaffolds met hoge porositeit resulteerde juist de statische celzaaimethode in de meest homogene celzaaiing en het hogere aantallen adherente cellen aan de scaffold dan de vacuüm celzaaimethode. Het toepassen van vacuüm op de cellen resulteerde niet in een verminderde hMSC proliferatie. De absolute aantallen cellen op de scaffolds nam af in de tijd na het zaaien op beide types scaffolds en met beide celzaaimethodes. Beide celzaaimethodes hadden een zaaiefficiëntie van rond de 90%. Op scaffolds met een lage porositeit gaf de hoogste celzaaidichtheid ook het hoogste aantal adherente cellen aan de scaffold.

In Hoofdstuk 3 wordt het zuurstofbereik waarin hMSCs prolifereren, metabool actief zijn en er tegelijkertijd transcriptie van AGF plaatsvindt, onderzocht. De proliferatie van hMSC was het hoogste bij 1% zuurstof. Bij 21% zuurstof, wat in feite voor uit beenmerg afkomstige hMSCs een hyperoxische situatie is, lieten de cellen de hoogste gecorrigeerde metabole activiteit zien. Bij omstandigheden met hypoxie was de gecorrigeerde metabole activiteit het hoogste bij 2% zuurstof. De transcriptie van AGF onder hypoxische omstandigheden is gerelateerd aan de transcriptie van AGF wanneer hMSCs blootgesteld worden aan 21% zuurstof. Aangezien HIF-1α-transcriptie standaard gebeurt, werd al verwacht dat de transcriptie van HIF-1α onder hypoxische condities niet significant verschilde van de transcriptie onder normoxische condities. De transcriptie van VEGF en ANG-1 daarentegen was significant hoger bij 2% O2 dan bij 21% zuurstof. Daarom concluderen we dat het zuurstofbereik waarin uit beenmerg afkomstige hMSCs een hoge celproliferatie vertonen, metabool actief zijn en een hoge transcriptie van AGF vertonen, 1-2% O2 is.

In Hoofdstuk 4 wordt een methode om zuurstof afgevende PTMC-CaO2 microbolletjes te maken beschreven. Daarnaast wordt het zuurstofafgifteprofiel van de aldus geproduceerde microbolletjes beschreven en wordt het effect van de aanwezigheid van de microbolletjes op de metabole activiteit van hMSCs die gekweekt worden onder omstandigheden met hypoxie onderzocht. Aangezien de microbolletjes zuurstof gaan afgeven op het moment dat zij in contact komen met water moet contact met water tijdens het productieproces vermeden worden. Daarom is een olie-in-olie oplosmiddel verdampingsmethode gebruikt, en polydisperse microbolletjes met een maximale diameter van 200 μm werden hiermee geproduceerd. In vitro, in simulated body fluid met daarin cholesterol esterase, gaven de PTMC-CaO2 microbolletjes zuurstof af gedurende ongeveer 20 dagen. De aanwezigheid van PTMC-CaO2 microbolletjes leidde tot hogere adherentie van hMSCs aan de microbolletjes dan aan celkweekplastic, wat suggereert dat de bolletjes niet cytotoxisch zijn. hMSCs hebben een hogere metabole activiteit wanneer zij onder hypoxische omstandigheden gekweekt worden in de aanwezigheid van zuurstof afgevende microbolletjes dan in de aanwezigheid van niet-zuurstof afgevende bolletjes na 7 dagen kweken. Dit suggereert dat de zuurstofafgifte vanuit de microbolletjes de hMSC-overleving verhoogt na langdurige blootstelling aan hypoxische omstandigheden.

De biocompatibiliteit van de zuurstof afgevende PTMC-CaO2 microbolletjes is onderzocht middels in vitro and in vivo tests, die gebaseerd zijn op ISO standard 10993-5. Deze worden beschreven in Hoofdstuk 5. Bij de in vitro tests, waarbij L929 muizenfibroblasten gekweekt werden met een PTMC-CaO2 microbolletjesextract in verschillende concentraties, werd cytotoxiciteit van hoge concentraties van het extract aangetoond. Lagere concentraties van het extract daarentegen, die meer in de buurt komen van de verwachte in vivo concentraties, leidden niet tot verhoogde celdood. Dit werd bevestigd in de in vivo tests. Wanneer de PTMC-CaO2 microbolletjes geïmplanteerd werden in subcutane pockets in muizen, werden geen nadelige effecten geobserveerd. Concluderend: de zuurstof afgevende microbolletjes zijn biocompatibel.

Als bewijs van het principe werden de zuurstof afgevende PTMC-CaO2 microbolletjes geïmplanteerd onder een met op toeval gebaseerde restvaatvoorziening, maar verder gedevasculariseerde huidflap in muizen (verder ‘gedevasculariseerde huidflap’ genoemd). De resultaten worden beschreven in Hoofdstuk 6. Histologische analyse van de huidflappen toonde aan dat de hoeveelheid necrose van het huidweefsel toenam vanaf de craniale basis van de flap richting het caudale einde van de flap. Dit impliceert dat er sprake is van een ischemische gradiënt in de huidflap, waarbij de craniale basis van de huidflap goed gevasculariseerd en niet ischemisch is, en het caudale uiteinde van de flap het slechtst gevasculariseerd en daarmee het meest ischemisch is. Huidflappen waaronder niet-zuurstof afgevende PTMC microbolletjes geïmplanteerd zijn, lieten significant meer necrose zien dan huidflappen waaronder zuurstof afgevende PTMC-CaO2 microbolletjes geïmplanteerd zijn op 3, 7 en 10 dagen na implantatie. Deze bevindingen suggereren dat de afgifte van zuurstof door de PTMC-CaO2 microbolletjes celdood kan voorkomen bij cellen die aan ischemische omstandigheden blootgesteld worden, waardoor de overleving van ischemisch weefsel verbeterd kan worden.

De uitkomsten van dit onderzoeksproject worden bediscussieerd en suggesties voor toekomstig onderzoek worden gegeven in Hoofdstuk 7, de algemene discussie. De zuurstof afgevende PTMC-CaO2 microbolletjes die onderzocht zijn in dit proefschrift zijn getest in een toepassing in huidweefsel in muizen. Het zou interessant zijn ook toepassingen in andere weefsels te onderzoeken, zoals botweefsel of hartspierweefsel. In slecht gevasculariseerd weefsel ondervinden cellen niet alleen een tekort aan zuurstof, maar ook aan andere nutriënten, zoals glucose, aminozuren en vitamines. Het suppleren van meer nutriënten dan glucose alleen aan cellen die aan ischemie blootgesteld worden zou de celoverleving ook verder kunnen verhogen. Dit is verder onderzoek waard. In dit onderzoeksproject zijn microbolletjes ontwikkeld die gedurende drie weken zuurstof afgeven. Wellicht is nog een langduriger zuurstofafgifte te bereiken door het matrixmateriaal aan te passen.

Concluderend: zuurstof afgevende PTMC-CaO2 microbolletjes, die in vitro gedurende ongeveer 20 dagen zuurstof afgaven, zijn geproduceerd. Bij in vivo tests bleken de microbolletjes biocompatibel te zijn en ze verminderden huidnecrose significant wanneer ze geïmplanteerd werden onder een gedevasculariseerde huidflap in muizen gedurende 10 dagen. Dit suggereert dat de zuurstof afgevende PTMC-CaO2 microbolletjes de celoverleving in ischemische weefsels faciliteren en weefselregeneratie onder ischemische omstandigheden kunnen verbeteren.

Voor niet-deskundigen

Door verschillende redenen kan het gebeuren dat er in het lichaam extra botweefsel nodig is, bijvoorbeeld als door een botbreuk of een infectie botweefsel verloren gegaan is. Als er maar een klein stukje bot mist, kan het lichaam daar wel weer nieuw bot in laten groeien. Dat lukt het lichaam niet wanneer er meer dan een paar millimeter bot mist. Om dan toch zo’n bottekort op te vullen, wordt er nu vaak door artsen ergens anders uit het lichaam van de patiënt bot weggehaald, bijvoorbeeld uit het bekken, en dat wordt dan op een plek met bottekort weer in het lichaam gezet. Het gebruik van bot elders uit het lichaam heeft ook nadelen. Er is namelijk maar een beperkte hoeveelheid bot dat gebruikt kan worden om bottekorten op te vullen, patiënten houden vaak last van de plaats waar extra bot weggehaald is en er is een extra operatie nodig om bot weg te halen. Het zou daarom erg mooi zijn als het lukt om op een plek waar je meer dan een paar millimeter bot tekort hebt, weer nieuw bot te laten groeien.

Er zijn kunstmaterialen te krijgen waarop en waarin het lichaam bot kan laten groeien. Daarvoor moet je die materialen als het ware inzaaien met cellen die bot kunnen vormen. Botvormende cellen zitten natuurlijk in bot zelf. Op veel andere plaatsen in het menselijk lichaam zitten cellen die nog geen botvormende cel zijn, maar dat wel kunnen worden. Dit zijn stamcellen. Ze worden zo genoemd omdat ze nog in verschillende celsoorten kunnen veranderen, in tegenstelling tot bijvoorbeeld vetcellen, huidcellen en bloedcellen. Deze stamcellen bevinden zich veel in het beenmerg en in het vetweefsel. Het gebruik van stamcellen heeft belangrijke voordelen ten opzichte van het gebruik van botcellen. Stamcellen zijn namelijk gemakkelijk uit beenmerg en vet te halen en ze zijn in vrij ruime hoeveelheid beschikbaar. Om aan kant-en-klare botcellen te komen, moet je botweefsel uit het lichaam halen om daar weer de cellen uit te halen. Bovendien is het ook erg lastig dan de botcellen levend uit het bot te krijgen, en al helemaal om veel botcellen te verkrijgen. Botcellen zijn dus niet zo geschikt om te gebruiken om een tekort aan bot op te vullen.

Om tekorten aan bot van hoogstens enkele millimeters groot weer dicht te laten groeien met botweefsel is zo’n kunstmateriaal met daarop stamcellen gezaaid redelijk geschikt; het lukt dan vaak wel om nieuw bot te laten groeien. Grotere bottekorten blijven vaak wel een probleem. Een belangrijke oorzaak daarvoor is dat in kunstmaterialen geen bloedvaten zitten. In ons lichaam zitten heel veel bloedvaten, zodat bij alle cellen in het lichaam bloed kan komen. In het bloed zit onder meer zuurstof en allerlei voedingsstoffen. Om cellen niet dood te laten gaan, hebben ze zuurstof en voedingsstoffen nodig. Als cellen dus op zo’n kunstmateriaal gezaaid zijn, maar geen zuurstof en voedingsstoffen krijgen omdat er geen bloedvaten zijn, gaan ze dood. Dan groeit er dus ook geen bot. Bij wat kleinere bottekorten kan er nog wel wat zuurstof en voedingsstoffen uit de omgeving doorsijpelen naar de cellen, maar bij grote bottekorten is dat onvoldoende. Vooral in het midden van zo’n bottekort groeit er dan geen nieuw botweefsel. Een goede aanvoer van zuurstof en voedingsstoffen is dus heel belangrijk voor het herstellen van botweefsel.

Met onze onderzoeksgroep hebben we hiervoor een oplossing bedacht. We hebben hele kleine bolletjes gemaakt die zuurstof afgeven. Ze worden laagje voor laagje afgebroken in het lichaam, en zo geven ze voor ongeveer 3 weken steeds een beetje zuurstof af. Die bolletjes kunnen gemengd worden met een kunstmateriaal om bot te vervangen. De stamcellen die op het kunstmateriaal zitten krijgen daarmee een soort van lunchbox met zuurstof mee op het moment dat ze in het lichaam geplaatst worden. Door de cellen wat extra zuurstof mee te geven hopen we dat de cellen langer overleven en dus meer tijd hebben om bot te laten groeien. Ook kunnen dan vanuit de omgeving bloedvaten ingroeien, zodat ook een langdurige bloedvoorziening ontstaat.

In het tweede hoofdstuk van dit boek staat beschreven hoe je het beste cellen kan inzaaien in kunstmaterialen. Dit verschilt een beetje per kunstmateriaal. We raden gebruikers van die kunstmaterialen dus aan om óf zelf te testen welke manier van cellen zaaien het beste werkt voor het materiaal dat ze gebruiken óf om te kijken wat bij andere onderzoekers het beste werkt voor het zaaien van cellen op een kunstmateriaal. Verder hebben we gekeken hoe de stamcellen, die wij uit beenmerg hebben gehaald, reageren op zuurstof. De resultaten hiervan staan in hoofdstuk 3. Als de cellen in een omgeving met 1-2% zuurstof gebracht worden, groeien ze snel, maar maken ze gelijk ook stofjes aan die ervoor zorgen dat er meer bloedvaten ingroeien. Als ze aan meer of minder zuurstof dan 1-2% blootgesteld worden, maken ze die stofjes niet meer aan, en groeien ze ook minder hard. Wat belangrijk is hierbij te bedenken, is dat we dit in het laboratorium getest hebben, met cellen die in een schaaltje gekweekt zijn. Het kan dus zijn dat als de stamcellen in het lichaam geplaatst worden, ze anders reageren op zuurstof. Dit moet nog verder onderzocht worden. In hoofdstuk 4 staat hoe de zuurstof afgevende bolletjes precies gemaakt worden. Ook hebben we gekeken hoe lang ze zuurstof afgeven. Dit blijkt bij laboratoriumtesten 3 weken te zijn. Voor hoofdstuk 5 hebben we getest met proeven in een laboratorium en met een proef met muizen of de bolletjes niet afgestoten worden door het lichaam. Het lichaam blijkt er gelukkig goed tegen te kunnen. Uiteindelijk wilden we ook weten of de zuurstof afgevende bolletjes ook helpen om weefsels waarin zuurstoftekort is toch in leven te houden. We hebben daarvoor bij muizen een huidflap op de rug gemaakt, waarvan de bloedvaten grotendeels doorgesneden waren. Bij de muizen die niet- zuurstof afgevende bolletjes onder de huidflap hadden gekregen ging het huidweefsel sneller dood dan bij muizen die wel zuurstof afgevende bolletjes onder de huidflap hadden gekregen. We denken dus dat de zuurstof afgevende bolletjes inderdaad helpen om weefsels waarin een zuurstoftekort is te laten overleven.

Deze resultaten lijken erg mooi, maar er zijn nog wel dingen die we misschien nog kunnen verbeteren. We weten immers nog niet of de zuurstof afgevende bolletjes ook helpen om meer botweefsel te vormen op een plek waar we dat willen. Daarvoor moeten de bolletjes nog in bot getest worden in plaats van alleen bij de huid. Ook kunnen we de bolletjes misschien nog verder aanpassen, zodat ze nog langer dan 3 weken zuurstof afgeven. Daarnaast geven de bolletjes alleen zuurstof af en geen andere voedingsstoffen, terwijl die ook nodig zijn. Misschien kunnen we in de toekomst ook wel bolletjes maken die ook voedingsstoffen afgeven.