{"id":9757,"date":"2026-04-08T12:01:32","date_gmt":"2026-04-08T12:01:32","guid":{"rendered":"https:\/\/www.proefschriftmaken.nl\/portfolio\/nina-wijnands\/"},"modified":"2026-04-23T07:58:11","modified_gmt":"2026-04-23T07:58:11","slug":"nina-wijnands","status":"publish","type":"us_portfolio","link":"https:\/\/www.proefschriftmaken.nl\/en\/portfolio\/nina-wijnands\/","title":{"rendered":"Nina Wijnands"},"content":{"rendered":"","protected":false},"excerpt":{"rendered":"","protected":false},"author":8,"featured_media":13112,"comment_status":"closed","ping_status":"closed","template":"","meta":{"_acf_changed":false,"footnotes":""},"us_portfolio_category":[45],"class_list":["post-9757","us_portfolio","type-us_portfolio","status-publish","has-post-thumbnail","hentry","us_portfolio_category-new-template"],"acf":{"naam_van_het_proefschift":"Arginine and the microcirculation","samenvatting":"Introductie\n\nOntstekingen en bloedvergiftiging, ook wel sepsis genaamd, vormen een groot probleem voor de gezondheidszorg, omdat deze aandoeningen gepaard gaan met een verhoogde kans op ziekte en sterfte. Dit zijn belangrijke onderliggende oorzaken in het ontstaan van functiestoornissen in vele organen tegelijk, ook wel multi-orgaan falen (MOF) genaamd. MOF ontstaat doordat de doorbloeding van deze organen verstoord raakt. Vooral de doorbloeding van de kleinste vaten, de microcirculatie genaamd, is belangrijk, met name die in het slijmvlies (mucosa) van de darm. Het darmslijmvlies beschermt het lichaam tegen ziekteverwekkers die via het maag-darmkanaal naar binnen kunnen komen. Een misschien nog belangrijkere taak van het darmslijmvlies is dat het zorgt voor de opname van essenti\u00eble voedingsstoffen, zoals bijvoorbeeld het aminozuur arginine. Arginine is het enige molecuul waar onze stofwisseling stikstofmonoxide (NO) van kan maken. NO is een van de belangrijkste vaatverwijdende stoffen. In weefsels met ontstekingen en tijdens bloedvergiftiging, concurreren ontstekingscellen (onder andere macrofagen) en de cellen die de bloedvaten bekleden, de endotheelcellen, om het gebruik van arginine voor deze NO productie. Een lage, maar continue aanwezige NO productie in bloedvaatwand is nodig voor een goede doorstroming, terwijl een hoge NO productie zorg draagt voor vernietiging van schadelijke micro-organismen, maar ook schade toebrengt aan het ontstoken weefsel. Op grond van deze kennis leek het logisch de beschikbaarheid van arginine te verhogen door extra arginine toe te dienen of de afbraak van arginine te verminderen. In de praktijk bleken de resultaten van deze aanpak in eerdere onderzoeken echter teleurstellend. Een oorzaak voor deze teleurstellende resultaten zou het gebruik van een verkeerd experimenteel model kunnen zijn. In de tot nu toe gebruikte modellen werden muizen ingespoten met een bloedvergiftiging veroorzakende stof, endotoxinen of lipopolysaccharide (LPS), maar omdat deze proeven van korte duur waren ontstond helemaal geen tekort aan arginine. Het eerste doel van ons onderzoek was dan ook het ontwikkelen van een langdurig model waarin wel een tekort aan arginine zou ontstaan en dat beter vergelijkbaar was met de zieke mens, waarin ook sprake is van een tekort aan arginine. Verder vonden wij het belangrijk niet alleen een nieuwe behandeling te vinden voor deze arginine tekorten, maar tevens meer kennis te verkrijgen over de regulering van de stofwisseling van arginine en NO tijdens deze aandoeningen. Het overkoepelende doel van dit proefschrift was dan ook het ontrafelen van de rol van de enzymen die betrokken zijn bij de aanmaak (argininosuccinate synthetase; ASS) en de afbraak van arginine (arginase, NO-synthase 2 en -3) tijdens ontstekingen en bloedvergiftiging.\n\nModel ontwikkeling\n\nIn hoofdstuk 4 wordt het muismodel met langdurige blootstelling aan endotoxinen beschreven. In dit model werd gedurende 18 uur endotoxinen in de bloedbaan toegediend, een stof die verantwoordelijk is voor de verschijnselen van bloedvergiftiging. In dit model werd vastgesteld dat de concentratie arginine na 12 uur ontoereikend werd voor een normale doorbloeding, hetgeen vergelijkbaar is met de arginine afname in de zieke pati\u00ebnt. Tevens werden de best bruikbare technieken en methoden getest om de doorstroming van het darmslijmvlies en de aanmaak van NO te meten in dit nieuwe model (tweede doel). Dit heeft geleid tot het meten van de microcirculatie in de darmmucosa van het middelste deel van de dunne darm, het jejunum, met een SDF-camera. Deze camera is alleen gevoelig voor licht dat door het hemoglobine, het zuurstofdragende eiwit in bloedcellen, wordt tegengehouden, zodat kleine bloedvaten als donkere structuren zichtbaar zijn. In onze studie wilden we natuurlijk ook weten hoeveel NO geproduceerd wordt in zieke en controle muizen, en of arginine toediening leidt tot meer NO productie. Het meten van NO is mogelijk doordat NO ingevangen kan worden in een in de bloedbaan ingespoten chemisch complex en wordt daarom ook wel NO \"spin trapping\" genaamd. Door de gevormde hoeveelheid van dit complex in een magnetisch veld te meten kan de productie van NO bepaald worden. In ons diermodel was sprake van een verminderde NO productie in de darm tijdens blootstelling aan endotoxinen (hoofdstukken 6-9). Met een fluorescerend koperhoudend complex dat NO bindt (Cu FL2E) in de cellen die de bloedvaten aan de binnenzijde bekleden (zgn. Endotheelcellen), konden we ook de NO productie daar meten. Ook in deze metingen zagen wij een duidelijk verminderde NO productie in dieren met blootstelling aan endotoxinen. Samenvattend laten de resultaten van hoofdstuk 4 zien dat het door ons ontwikkelde diermodel en de gebruikte technieken geschikt zijn om de bijdragen van de belangrijkste enzymen voor de productie van arginine en NO, en de effectiviteit van de door ons bedachte behandelingen voor een verbeterde doorbloeding van het darmslijmvlies te toetsen (hoofdstukken 5-9).\n\nRol van de ontstekingsreactie\n\nEen belangrijke oorzaak van het tekort aan arginine tijdens een ontsteking is het verhoogde verbruik van arginine. Het verbruik van arginine neemt toe doordat de activiteit van 2 van de enzymen die arginine omzetten (arginase-1 en NOS2) verhoogd is in ontstekingen. Dit leidt tot een verminderde beschikbaarheid van arginine voor NO productie (via NOS3) in de (endotheel)cellen die de bloedvaten aan de binnenzijde bekleden en een verminderde doorstroming van die vaten. Als model hebben wij de effecten van het inspuiten van een gezuiverde arginase oplossing in de bloedbaan van muizen bestudeerd (derde doel). In hoofdstuk 5 laten we zien dat deze ingreep tot een snelle verlaging van de arginine concentratie in de bloedbaan en weefsels en een snelle vermindering van de doorbloeding van het darmslijmvlies leidt. Het toedienen van extra arginine aan deze muizen leidde echter niet tot een verbetering van het ziektebeeld, terwijl toediening van citrulline, een voorloper van arginine, wel dat effect had. Deze uitkomst was voor ons een aanwijzing dat citrulline toediening een veelbelovende ingreep is voor toestanden waarin de afbraak van arginine, in dit geval door arginase, in korte tijd sterk toegenomen is. Mogelijk is vermindering van de arginase activiteit ook een goede behandelwijze voor aandoeningen waarbij sprake is van een verhoogde arginine afbraak door een toegenomen arginase activiteit (vierde doel, hoofdstuk 6). Om antwoord te krijgen op deze vraag hebben wij een muis ontwikkeld die arginase in bepaalde cellen van het lichaam mist. Deze muizen, Arg1 fl\/fl \/Tie2-Cre tg\/- genaamd, kunnen geen arginase-1 meer maken in cellen die de binnenzijde van bloedvaten bekleden, de endotheelcellen, en in cellen die uit het beenmerg afkomstig zijn (bijvoorbeeld macrofagen). Door de afwezigheid van arginase-1 in deze cellen zal er mogelijk meer arginine beschikbaar zijn voor de NO productie. De afwezigheid van arginase-1 zorgde voor een hogere concentratie arginine in het bloed en een hogere NO productie, onder andere in de darm tijdens blootstelling aan endotoxinen. Helaas verbeterde de doorbloeding van het darmslijmvlies niet, waarschijnlijk doordat het NO door het verkeerde enzym gemaakt werd. Een ontstekingsreactie doet namelijk vooral de activiteit van het NOS2 enzym toenemen. Inderdaad bleken de macrofagen van muizen die geen arginase-1 enzym kunnen maken, meer NO te maken als ze blootgesteld werden aan LPS dan macrofagen van controle muizen. Door een specifieke blokkering van NOS2 (1400W) aan Arg1 fl\/fl \/Tie2-Cre tg\/- muizen met een ontstekingsreactie toe te dienen, verminderde de NO productie inderdaad. Samenvattend hebben deze proeven laten zien dat de afwezigheid van arginase-1 leidt tot een heftiger ontsteking als gevolg van een toegenomen NO productie door NOS2. Wij vermoeden dat dit toegenomen arginine verbruik leidt tot een verminderde NOS3-afhankelijke vaatverwijding. Om deze reden dient arginase activiteit niet geremd te worden in patienten met een ontsteking.\n\nRol van het endotheel\n\nHet vijfde doel van dit proefschrift was de gevolgen van een verminderde NO productie op de doorstroming van de microcirculatie in de darm te onderzoeken. Uit de resultaten van hoofdstuk 7 blijkt dat een tekort aan arginine tijdens blootstelling aan endotoxinen, leidt tot een afname van de NO productie en een verminderde doorbloeding van de darm. Omdat de arginine concentraties in het bloed van pati\u00ebnten met een bloedvergiftiging verlaagd zijn en de NO productie verminderd is, is het herstellen van de beschikbaarheid van arginine voor een verbeterde doorstroming van de organen een belangrijk therapeutisch doel. Aangezien arginine uit het aminozuur citrulline gemaakt wordt door het enzym ASS en dit enzym ook aanwezig is in de endotheelcellen, zou toediening van citrulline aan patienten met bloedvergiftiging mogelijk kunnen leiden tot verbetering van de doorstroming van de microcirculatie (zesde doel). In hoofdstuk 7 hebben wij de toediening van citrulline vergeleken met die van arginine of alanine (een aminozuur waar geen NO uit gemaakt kan worden). Toediening van citrulline verhoogde niet alleen de plasma- en weefselconcentraties van arginine en citrulline, maar herstelde ook de NO productie in de darmen. Tevens zorgde alleen citrulline voor een verbeterde doorbloeding in het darmslijmvlies, terwijl arginine toediening geen verbeterde doorbloeding opleverde. Uit de resultaten van deze studie valt af te leiden dat citrulline een veelbelovend geneesmiddel voor patienten met een bloedvergiftiging is. Het volgende doel van dit proefschrift was te onderzoeken welke rol NO productie in de endotheelcellen van de bloedvaten speelt bij de doorstroming van microcirculatie in het slijmvlies van de darm (zevende doel). Aangezien de positieve effecten van citrulline toediening op NO productie in patienten met bloedvergiftiging afhankelijk zijn van de omzetting van citrulline in arginine door het enzym ASS, hebben wij de rol van dit enzym tijdens blootstelling aan endotoxinen onderzocht (achtste doel; hoofdstuk 8). Voor het beantwoorden van de zevende en achtste doelstelling hebben wij een muis ontwikkeld die het ASS enzym mist in de endotheelcellen en de cellen afkomstig uit het beenmerg (Ass fl\/fl \/Tie2-Cre tg\/- muizen). Deze muizen hadden, net zoals muizen zonder arginase in dezelfde cellen, een hogere arginine concentratie in bloed en weefsels dan de controle groep. Deze hogere arginine concentraties leiden echter niet tot een toename van de NO productie of verbetering van de doorstroming van het darmslijmvlies. Deze resultaten laten zien dat de aanmaak van arginine in de endotheelcellen noodzakelijk is voor het gunstige effect van citrulline toediening bij ontstekingsreacties. Deze conclusie wordt ondersteund door onze waarnemingen in muizen die het NOS3 enzym missen (dit is verantwoordelijk voor de NO productie in de endotheelcellen die leidt tot vaatverwijding) en geen toename in de doorbloeding hebben. Net als Ass fl\/fl \/Tie2-Cre tg\/- muizen hebben ook deze muizen een verminderde doorbloeding van het darmslijmvlies. Voorts hebben macrofagen zonder ASS een verminderde ontstekingsreactie vergeleken met macrofagen van controle dieren. Samenvattend kunnen wij concluderen dat bij een langdurig heftige ontstekingsreactie of bloedvergiftiging niet alleen de beschikbaarheid van substraat, maar ook de functie van de enzymen zelf behouden dient te worden om voldoende NO aan te kunnen maken en de doorbloeding van de darm op peil te kunnen houden. Als laatste experiment hebben wij in hoofdstuk 9 (negende doel) van dit proefschrift dan ook de rol van de NO producerende enzymen op de NO productie tijdens een bloedvergiftiging nagegaan. Voor dit onderzoek hebben wij gebruik gemaakt van knock-out muizen, d.w.z. van muizen die het Nos2 (Nos2-\/-), Nos3 (Nos3-\/-), of beide genen (Nos2-\/-\/Nos3-\/-) niet meer hebben. In Nos3-\/- en Nos2-\/-\/Nos3-\/- muizen waren de negatieve effecten van blootstelling aan endotoxinen op de doorbloeding afwezig. Ondanks aanzienlijk hogere arginine bloedspiegels in deze muizen, bleven de gunstige effecten van citrulline toediening op de doorbloeding van het darmslijmvlies uit. Deze gegevens tonen aan dat alleen de NO productie door NOS3 de doorbloeding van het darmslijmvlies beinvloedt.\n\nVan muis tot mens\n\nOp grond van de gunstige effecten van L-citrulline toediening tijdens onze experimentele studies, werd als volgende stap het effect van L-citrulline toediening in de mens getest (tiende doel). Voordat het effect van citrulline op de arginine en NO productie en de slijmvliesdoorbloeding in ernstig zieke patienten met sepsis getest kon worden, diende het effect eerst in gezonde proefpersonen te worden aangetoond. Voor het onderzoeken van het effect van citrulline op ontstekingsreacties onderzochten wij een door duursport ge\u00efnduceerd ontstekingsmodel in de darm. Dit model werd gekenmerkt door een verminderde doorbloeding van de darm en een toegenomen ontstekingsreactie in de darm en kan leiden tot een verhoogde doorlaatbaarheid van de darmwand voor bacteri\u00ebn. In hoofdstuk 10 tonen we aan dat citrulline toediening als een drankje, zowel de bloedspiegels van citrulline en arginine als de beschikbaarheid van arginine voor NO vorming verbetert ten opzichte van een placebo (nep) behandeling. Bovendien werd minder darmschade waargenomen. Ook verhoogde citrulline de doorbloeding van haarvaten onder de tong. Deze resultaten suggereren dan ook dat er sprake zou kunnen zijn van een verbeterde darmdoorbloeding. Als volgende stap, na het afronden van mijn proefschrift, zouden we citrulline willen toedienen aan ernstig zieke pati\u00ebnten met een bloedvergiftiging om vast te stellen of deze ingreep ook leidt tot een verbetering van de doorbloeding in intensive-care pati\u00ebnten en geen bijkomende nadelige effecten op de bloedsomloop heeft. Momenteel voeren wij de testfase van dit onderzoek uit. De eerste resultaten lijken veelbelovend.\n\nAlgemene conclusie\n\nIn dit proefschrift tonen we aan dat een te lage argininespiegel en te geringe NO productie in mensen en dieren met langdurige ontstekingsreacties of een bloedvergiftiging een nadelig effect heeft op de doorstroming van de microcirculatie. In dit proefschrift ontwikkelden wij een diermodel dat langdurig aan endotoxinen, de ziekmakende stof bij een bloedvergiftiging, werd blootgesteld en dat, net als de mens in een vergelijkbare situatie, een tekort aan arginine ontwikkelt. Het tekort aan arginine leidde in ons model tot een verminderde NO productie en doorbloeding van het slijmvlies van de darm. Toediening van extra citrulline zorgde ervoor dat de NO productie en de doorbloeding zich herstelden ondanks de ontstekingsreactie, terwijl dat niet gebeurde tijdens toediening van arginine. Verder toonde ons model aan dat de balans tussen het arginine verbruik (via arginase-1 en NOS2) en productie (via ASS) gehandhaafd moet blijven om de beschikbaarheid van arginine in stand te houden tijdens langdurige ontstekingsreacties. Op dit moment lijkt het erop dat het behoud of verbeteren van de functie van ASS en NOS3 tijdens een bloedvergiftiging de sleutel is van een succesvolle aanpak om het tekort aan arginine en de gebrekkige doorstroming van de darm door citrulline toediening te herstellen.\n\nValorization\n\nIn the following paragraphs we will describe the value of our work for society and the economy. Furthermore, we will highlight which target population will benefit from our newly developed model and therapeutic strategy. Finally we will shortly describe the innovation of our model and the utilization of our knowledge.\n\nSocial and economic value of the current thesis\nSepsis is a major health problem, which is associated with high rates of morbidity and mortality. The reported incidence varies between 75 to 300 per 100,000 patients worldwide, with mortality rates of approximately 25%. However, if complicated by multiple organ failure due to an impaired microcirculation, the mortality rates double. This results in high socio-economic costs. As described in chapter 2 of this thesis, an imbalance in NO production by NOS3 and NOS2 is hypothesized to play a key role in the development of multiple organ failure during sepsis and inflammatory conditions. Therefore, restoring NO production from arginine by the proper cells and enzymes in these conditions has been the subject of numerous studies over the past decades. Thus far, there is no definite treatment, so that the search for good therapeutic interventions is still ongoing. Previous nutritional interventions focussed on arginine supplementation, but the outcomes of these treatments differed widely, with either increased, unchanged, or decreased morbidity and mortality. The disparate outcomes of the human studies appear to result from the experimental animal models used to simulate and treat sepsis. Thus far, the acute sepsis model, which takes only a few hours, is usually used, but this model does not cause arginine deficiency. Therefore, the first goal of the current thesis was the development of an experimental model that mimics the human arginine-deficient state during endotoxemia. As described in detail in Chapter 4, we developed a mouse model with an 18h infusion of endotoxin that causes a decreased arginine availability and a diminished NO production and decreased microcirculation in jejunal tissue as found in septic human patients. Since our model mimics the human situation better with respect to the functional arginine deficiency than previously used models, new interventions tested in this model may be better suitable to have outcomes that better predict efficacy in humans than the previously used acute models. To develop a new therapeutic approach for sepsis, we first investigated whether arginine would be a suitable substrate in our model. As hypothesized, the results of our study show that arginine supplementation did not restore arginine availability and microcirculation during endotoxemia. Therefore, we conclude that arginine is not a suitable substrate for the treatment of these disturbances in NO production. In this thesis we further showed that L-citrulline supplementation is a good therapeutic strategy to restore the arginine availability in the cells of the jejunum during experimental endotoxemia. L-citrulline supplementation even resulted in an improved microcirculation and maintenance of the gastro-intestinal barrier in healthy athletes. Based on these beneficial results of L-citrulline supplementation, the findings during our study are potentially of high social and economic value for the medical society and the world of sports.\n\nTarget population\nThe results of this thesis are of interest to several target groups within the research field and health care. At first, the results presented in this thesis provide new insights for the development of specific nutritional supplements for patients with a disturbed arginine metabolism, such as septic patients. Therefore, the data of this thesis may be of special interest to pharmaceutical companies to develop new nutritional formulas for clinical usage in patients with disturbances in arginine metabolism. In line, these results are important for health care workers in the field of intensive care medicine, which deal with these septic patients daily. However, this arginine deficiency is not only present in inflammatory conditions, but is also present in abnormal fracture healing, disturbed wound healing and cardiovascular diseases. Therefore, the results of this thesis will be of interest to a much broader audience, including surgeons, cardiologists, and investigators in the biomedical field with special interest in endothelial dysfunction and microcirculation. Also, athletes and investigators in the field of sport medicine are likely to be interested, based on the beneficial results of L-citrulline supplementation during strenuous exercise.\n\nKnowledge utilization\nThe knowledge obtained from our research in the area of nutritional supplementation in patients with arginine deficiency will be valorized through its application in future studies focused on improved metabolism during inflammatory conditions. The knowledge received from this thesis can already be incorporated in the current standard treatment of critical ill patients, focusing on enhancement of the microcirculation. Furthermore, as already mentioned in the previous paragraph the insights from our studies will help to develop nutritional strategies targeting the endothelial function in several different pathophysiological states. This eventually will lead to less social economic cost based on decreased hospitalization and diminished morbidity and mortality.\n\nInnovation\nThe search for a good therapeutic strategy to maintain a functional microcirculation during sepsis and endotoxemia has been the subject of many different studies over the past decades. However, experimental studies used acute sepsis models, which are not a reliable model to study the human situation. In this regard, the present thesis exhibits various novel findings and insights. First, the experimental model described in this thesis is the first model, which uses a prolonged endotoxemia to test the therapeutic strategies targeting the arginine availability and metabolism. Furthermore, our results are the first to show that citrulline is a suitable substrate to improve arginine availability and microcirculatory function during inflammatory conditions, and, therefore, may be a promising new therapeutic strategy in patients. The novelty of the model and therapeutic approach has not gone unnoticed, as we were awarded the International Sepsis Forum award of the European Society of Intensive Care Medicine (ESICM) in 2010 for the best new research on therapeutic interventions in the treatment of human sepsis. These studies will serve as basis for future studies that address arginine and NO deficiencies in human patients, especially in the (critically) ill.","summary":"Introduction\n\nSepsis and inflammatory conditions accompanied by endotoxemia are an important health problem that is associated with high rates of morbidity and mortality [1]. The development of multiple organ failure (MOF) [1-6] is a major determinant to the detrimental outcome of these syndromes as a result of an auto-destructive or dysfunctional immune response [7]. Derangement of the microcirculatory flow is one of the other critical pathogenic events during sepsis and appears to be an important direct underlying cause for the development of MOF [8-10]. Preservation of the microcirculation, therefore, appears to be essential during these conditions. Especially preservation of the microcirculation in the intestinal mucosa seems to be a key factor to prevent organ failure during sepsis. The largest part of the intestinal blood flow (70-80%) passes through the mucosal layer, the metabolically most active component of the gut, since it is, in addition to nutrient absorption from the lumen, responsible for the barrier function as part of the host immune response [11].\n\nThe intestinal mucosa is also the site for absorption of amino acids [12]. Glutamine is the precursor amino acid of arginine, via conversion to citrulline [13,14]. Arginine has exhibited special attention over the past decades, as arginine is the sole precursor of nitric oxide (NO) and essential for vasodilatation. Unfortunately, enhanced arginine consumption by arginase and NOS2 and impaired arginine de novo synthesis from citrulline (possibly due to a decreased ASS activity), combined with a decreased supply of arginine, result in impaired arginine availability during inflammatory conditions [15-17]. As a result, the arginine deficiency during sepsis and endotoxemia [15,17-19] further contributes to the microcirculatory disturbances in sepsis. Basically, increasing the arginine availability with L-arginine supplementation would be a good therapeutic strategy, but this approach led to an inconclusive outcome, with some studies demonstrating beneficial results, while others showed an increased mortality or no effect on mortality [20-25]. The quest for the best intervention to enhance the arginine-NO metabolism and microcirculatory flow during sepsis and endotoxemia remained. In vitro studies have shed new light on the potential role of citrulline supplementation as arginine precursor, based on the compartmentalization of arginine as present within e.g. endothelial cells [26-29]. These studies indicated that endothelial NOS (NOS3) possibly exists in a complex with ASS and, therefore, benefits from citrulline supplementation to produce NO in case of arginine deficiency. Based on these in vitro studies and the previous work on arginine supplementation, citrulline may be able to restore intracellular arginine concentrations and the microcirculation during endotoxemia. However, in depth knowledge, at the enzyme level, of the pathophysiological changes of the arginine-NO metabolism during endotoxemia is essential. Therefore, the overall aim of this thesis was to unravel the role of the different enzymes (arginase, argininosuccinate synthetase and NOS2 and NOS3) and their interrelationship during disturbances in the arginine metabolism as present during endotoxemia. Thus far most experimental models study arginine-NO metabolism in an acute model in combination with drugs that modulate enzyme activity. However, patients with sepsis usually do no present during the acute phase of sepsis, but have developed this clinical state in the course of a few days instead of hours. Furthermore, drugs that modulate these enzymes are all arginine homologs and may, therefore, affect not only more than one enzyme, but also the activity of arginine transporters. We, therefore, developed a prolonged experimental endotoxemia model that better mimicks the human situation. We then investigated the potential effects of L-citrulline supplementation on arginine-NO metabolism and microcirculatory flow, and the role of the respective enzymes in NO production in this model. This resulted in the formulation of several aims for the studies reported in this thesis:\n\n1. To develop an experimental model, which represents the arginine-deficient state during a prolonged inflammatory response.\n2. To determine the best diagnostic tools to investigate the microcirculatory flow during modulations of arginine-NO metabolism.\n3. To unravel the role of enhanced arginine consumption by increased arginase activity on NO production and microcirculatory flow.\n4. To improve our knowledge on the complex interrelationship in the inflammatory response between arginase and NOS2 on the regulation of the arginine availability in our new model.\n5. To investigate the consequences of an impaired arginine-NO metabolism on NO production and microcirculatory flow.\n6. To investigate whether L-citrulline or L-arginine supplementation is the best therapeutic strategy in endotoxemia to improve the arginine-NO metabolism in relation to the microcirculation.\n7. To provide insight into the role of endothelial NO production on microcirculatory flow during endotoxemia.\n8. To investigate the influence of an impaired arginine de novo synthesis, as a result of ASS deficiency, on arginine concentrations and microcirculatory flow during endotoxemia.\n9. To improve our knowledge on the key enzymatic mechanisms which control NO production during endotoxemia.\n10. To provide evidence of the potential role of L-citrulline as substrate for enhanced arginine de novo synthesis during conditions with clinical impairment of the intestinal perfusion.\n\nModel development\n\nThe first aim of this thesis was to develop an experimental model, which represents the arginine-deficient state during prolonged and severe inflammation as observed in humans with persistent sepsis. In the past, acute experimental animal models were used to study this complex interplay, especially murine endotoxemia models [30-34]. Unfortunately and in contrast to the arginine-NO metabolic derangements reported in human sepsis, a deficit of arginine in the plasma pool was not found in these acute models [30-34]. In part 1 of this thesis, in chapter 4, we describe the development of our prolonged murine endotoxemia model that mimics the characteristic arginine depletion in human inflammatory conditions (first aim). In this model, mice received a continuous infusion of LPS during an 18 hours period to determine the time-point at which the characteristic arginine deficiency developed. As in previous experimental studies and during the acute phases of human sepsis, an initial increase in arginine plasma concentrations is present as a result of an enhanced protein breakdown and increased generation of arginine from glutamine and citrulline as a response to the increased consumption [35]. In line, in our prolonged endotoxemia model, the initial increase in arginine plasma concentrations occurred around 8 hours of endotoxemia (LPS infusion). After 12 hours of infusion, a significant decrease in arginine plasma concentrations developed compared to basal concentrations and most importantly also compared to the initial increase in arginine at 8 hours of endotoxemia.\n\nIn chapter 4 we also determined the best diagnostic tools to investigate the microcirculatory flow and NO production under basal and endotoxemic conditions during modulations in arginine-NO metabolism (second aim). The approach was based on the technique described by Massberg et al. [36] to evaluate mucosal jejunal microcirculatory flow. A jejunal segment was opened to microscopically visualize the inner surface of the intestine and to reveal the microcirculatory flow in the mucosa with a sidestream dark-field (SDF) imager [37,38]. The SDF-imager is applied on tissue surfaces such as mucosa and uses 530nm light that is absorbed by haemoglobin in red blood cells to measure perfused vessels [39]. The microcirculation is thought to be the motor of sepsis [40], so that measurements of the microcirculation are probably a good indicator of the perfusion of other vascular beds [41]. We specifically selected the gut as the circulation of the intestines is the first end organ during inflammatory conditions to dysfunction and the last organ to recover [42]. Practically, it is also easily accessible, which minimizes confounding surgical trauma.\n\nTo determine NO production in tissue of control and endotoxemic animals, we used NO spin trapping [43]. NO spin trapping is a sufficiently accurate method that allows assessment of the influence of endotoxemia on NO production in our model, as we could demonstrate an impaired NO production in the jejunal villi during endotoxemia (described in chapter 6-9). Moreover, the carotid arteries of our experimental mice were used to measure NO production in endothelial cells with 2-photon laser microscopy and a NO-sensitive copper-based fluorescent probe (Cu2FL2E). In agreement with the spin trapping measurements, assays with the 2-photon laser microscope showed that endothelial NO production was significantly reduced during endotoxemia compared to control. In conclusion, the results of chapter 4 suggest that this newly developed model of prolonged endotoxemia and the above mentioned NO-detection techniques are suitable to investigate therapeutic strategies to enhance NO production and to unravel the role of the key enzymes in this pathway (described in chapter 5-9).\n\nRole of inflammation\n\nThe enhanced arginine consumption during inflammatory conditions is a major contributor to the development of arginine deficiency during sepsis or endotoxemia [44]. Both arginase-1 and NOS2 enzymes are upregulated during inflammation and use the same substrate, contributing to the reduction in arginine availability [44-46]. Furthermore, the increased consumption of arginine by these enzymes may result in a lower availability arginine for NOS3, and ultimately results in microcirculatory dysfunction.\n\nSince the expression of arginase is upregulated under conditions such as sepsis and endotoxemia, improving intracellular arginine availability may be effective (third aim). To address this question, we used a model in which arginase was injected into the circulation. This approach separates the effects of low circulating arginine concentration from that after upregulation of arginase and NOS2 expression in tissues. In chapter 5 we show that intravenous arginase injection caused an acute decrease in plasma and tissue arginine concentrations, resulting in an acutely occurring impairment of microvascular perfusion. L-citrulline, but not L-arginine supplementation was capable of enhancing both plasma and tissue arginine concentrations, which led to an increased NO production and improved microcirculatory flow. Thus, during an acute condition with enhanced catabolism of arginine by arginase, citrulline is capable of restoring the cellular arginine concentrations and improves the end organ microcirculation.\n\nReducing the effects of arginase during conditions with increased arginase activity such as sepsis and endotoxemia may therefore be a starting point for treatment. This hypothesis was tested in an arginase-1-deficient mouse model was used (fourth aim; chapter 6). These Arg1 fl\/fl \/ Tie2-Cre tg\/- mice did not express arginase-1 in endothelial and hematopoietic cells. Deficiency of arginase-1 resulted in higher plasma arginine concentrations, and enhanced NO production in endothelial cells and jejunal tissue during endotoxemia. However, this increase in NO production had no effect on microcirculatory flow, indicating that it did not occur in the endothelium. Supplementation of L-citrulline in these animals also did not enhance the NO production or microcirculatory flow. In agreement, we found that the enhancement of NO production was due to enhanced NOS2 activity and was accompanied by an increased inflammatory response. In vitro data from cultured bone-marrow-derived macrophages of arginase-1-deficient animals confirmed this higher inflammatory response to endotoxin than seen in control fl\/fl \/ Tie2-Cre tg\/- littermates. The effects of treatment of Arg1 fl\/fl \/ Tie2-Cre tg\/- mice with the specific NOS2 inhibitor 1400W further implicated NOS2 in the enhanced capacity to produce NO. In conclusion, arginase-1 deficiency facilitates a NOS2-mediated pro-inflammatory activity at the expense of NOS3-mediated endothelial relaxation. Based on the complex regulation between NOS2 and arginase, inhibition of arginase should be avoided during inflammatory conditions as this may lead to detrimental results.\n\nRole of the endothelium\n\nThe fifth aim of this thesis was to investigate the consequences of an impaired arginine-NO metabolism on microcirculatory function. As briefly described above, arginine deficiency during endotoxemia resulted in an impaired NO production in jejunal tissue (Chapter 7). This impaired NO production was related to a decreased microcirculation in these animals. In patients with severe infection or systemic inflammatory response syndrome (SIRS), microcirculatory function is also impaired and NO production is disturbed [47-50]. Efforts to improve organ perfusion are therefore an important therapeutic target. Based on the impaired arginine availability during sepsis and decreased citrulline concentrations, and the tight coupling between NOS3 and ASS in endothelial cells [27], supplementation of L-citrulline may be a promising option to restore these reduced concentrations (sixth aim). In chapter 7, we supplemented our chronic endotoxemia model with L-citrulline, L-arginine or the isocaloric placebo L-alanine. L-citrulline supplementation increased plasma and tissue concentrations of arginine and citrulline, restored the intracellular NO production in the intestine, and improved intestinal microvascular perfusion compared to L-arginine supplementation. Furthermore, the beneficial effects of L-citrulline supplementation were accompanied by an increased phosphorylation of Ser 1177 in NOS3 (implying activation) and a decrease in NOS2 content. These effects were not present in the L-arginine supplemented animals. Therefore, these data suggest that citrulline supplementation is a key factor to increase intracellular arginine availability for NOS3-mediated NO production and thereby improve organ perfusion during endotoxemia.\n\nBecause of the beneficial effects of L-citrulline supplementation on NO production during endotoxemia require conversion of citrulline into arginine, we investigated the role of ASS on NO production and on microcirculatory flow during endotoxemia (seventh aim; chapter 8). Therefore, an endothelium- (and macrophage-) specific ASS-deficient mouse was developed (ASS fl\/fl \/ Tie2-Cre tg\/- mice). While ASS-deficient mice exhibited a higher plasma arginine concentration than controls, this was not associated with an enhanced NO production in endothelial cells or jejunal tissue during endotoxemia. Furthermore, an impaired jejunal microcirculation was observed during endotoxemia in these animals. These results show that de novo arginine synthesis in endothelial cells is necessary for the beneficial effect of L-citrulline supplementation during endotoxemia (eighth aim). This concept was con\ufb01rmed by the demonstration that Nos3-deficient mice exhibited similar microcirculatory disturbances as ASS-deficient mice under endotoxemic conditions. In macrophages intracellular arginine resynthesis for NOS activity only becomes essential when extracellular arginine is deprived [51], such as in prolonged endotoxemia [52,53] or sepsis [18,30,52,54]. In our study, cultured bone marrow-derived macrophages of ASS-deficient animals developed a lower inflammatory response to endotoxin (reduced cytokine and nitrite production) than those of control littermates. Thus, reduced ASS activity in ASS fl\/fl \/ Tie2-Cre tg\/- mice resulted in endothelial and macrophage dysfunction.\n\nCollectively, we can conclude that during endotoxemia not only substrate availability, but also enzyme functionality has to be preserved for NO synthesis and microcirculatory flow. Earlier studies had suggested that in the absence of NOS3, NOS1 is capable of maintaining the NO production in the microcirculation. This hypothesis was based on the observation that compensatory upregulation of NOS1 activity was responsible for normal angiogenesis [55] and an adequate NO production in Nos3-deficient [55-59]. These findings were the basis to clarify the role of the NOS enzymes [56-60] on NO production during endotoxemia (ninth aim). In Nos3 -\/- and Nos2 -\/- \/ Nos3 -\/- double knockout mice, the negative effects of endotoxemia were absent. Moreover, the beneficial effects of citrulline supplementation during LPS infusion on the microcirculation were not present in these mice, although, as expected, citrulline significantly enhanced plasma arginine concentration in all mouse strains. These data show that only NOS3 produces NO that will increase the circulation in the jejunal mucosa. In agreement, clinical studies found that polymorphisms in the Nos3 gene [61] are associated with several different pathophysiological responses to shock, impaired organ function [62] and an increased risk for cardiovascular disease [63]. The extent of the functional NOS3 inhibition in patients with prolonged sepsis and multiple organ failure is not known at present.\n\nFigure 1. The complex interplay of arginine-NO metabolism during endotoxemia. During endotoxemia arginine deficiency occurs as a result of an impaired conversion of glutamine, a decreased arginine uptake in the intestinal villi and an enhanced consumption by inflammatory cells. This arginine deficiency results in a diminished availability for NOS3 in the endothelial cells, which results in NOS3 uncoupling and an impaired microcirculation (left in illustration). L-citrulline supplementation during endotoxemia restores the intracellular and extracellular arginine concentrations, and leads to enhanced arginine availability for NOS3 and restores microcirculatory flow (right in illustration).\n\nPlasma amino acid concentrations (A), and microcirculatory (B) and macrocirculatory effects (C) during L-citrulline infusion in a septic ICU patient. Arginine Citrulline Ornithine Perfused vessels Systolic Diastolic MAP.\nFigure 2. Plasma arginine, citrulline and ornithine concentrations (\u03bcmol\/L) (A), and microcirculatory (B) and macrocirculatory effects (C) during L-citrulline infusion in a septic ICU patient.\n\nTransitional aspects\n\nBased on the beneficial effects of L-citrulline supplementation in experimental studies, the effects of L-citrulline supplementation was tested in humans (tenth aim). Prior to a study in critically ill patients, the effect of L-citrulline on arginine availability and the intestinal microcirculation was studied in healthy controls. Enteral supplementation is feasible in humans as oral citrulline supplementation exhibits less gastrointestinal discomfort than arginine [64,65]. We used an exercise-induced inflammatory model to determine the potential role of L-citrulline as substrate for enhanced de novo arginine synthesis during impaired intestinal perfusion in healthy subjects. This model is characterized by strenuous exercise-induced splanchnic hypoperfusion associated with small intestinal injury and loss of gut barrier function [66].\n\nIn chapter 10, we show that oral L-citrulline supplementation significantly enhanced both plasma citrulline and arginine levels compared to placebo and enhanced arginine availability. Previous human [64,67-69] and experimental studies with L-citrulline supplementation [70] support this finding. In addition, L-citrulline intake reduces small intestinal cellular injury. In line with these data, L-citrulline was recently shown to reduce intestinal injury after experimentally induced small bowel obstruction [71] and gastric mucosal injury as a consequence of ischemia-reperfusion [72].\n\nIn accordance, our study revealed that oral supplementation of L-citrulline prior to a condition with splanchnic hypoperfusion improves sublingual microcirculation, which strongly suggests improved intestinal microcirculation [41]. The next step is to determine whether L-citrulline improves microcirculatory function in septic ICU patients without detrimental systemic hemodynamic effects. In the pilot phase of our study, preliminary data of a patient receiving a continuous enteral supplementation with L-citrulline during 8 hours, suggest improvement of microcirculatory measurements without systemic hemodynamic side-effects (Figure 2A-C).\n\nOverall conclusion\n\nIn this thesis we demonstrated that arginine deficiency during endotoxemia and inflammatory conditions is detrimental for the microcirculatory flow and endothelial NO production. We developed a prolonged endotoxemia model which mimicked the deficiency of arginine as present during human sepsis. This arginine deficiency resulted in an impaired NO production and microcirculatory flow. L-citrulline supplementation restored NO production and microcirculatory flow during endotoxemia, whereas supplementation with L-arginine did not. Furthermore, we showed in this model that the balance between arginine consumption (arginase-1 and NOS2) and production (ASS) has to be maintained to ensure arginine availability during inflammatory conditions. Competition for arginine between the arginase\/NOS2 and the ASS\/NOS3 enzymes modulates the effects of therapeutic interventions that aim to improve the microcirculatory response during endotoxemia. Addressing the reduction of ASS and\/or NOS3 function during sepsis may be the key to the ability to restore this arginine deficiency and microcirculatory function with L-citrulline. In this respect it is promising that L-citrulline supplementation preserves splanchnic perfusion and reduces intestinal injury in athletes. Preliminary data during sepsis also support the experimental findings in this thesis.","auteur":"Nina Wijnands","auteur_slug":"nina-wijnands","publicatiedatum":"27 november 2015","taal":"NL","url_flipbook":"https:\/\/ebook.proefschriftmaken.nl\/ebook\/ninawijnands?iframe=true","url_download_pdf":"","url_epub":"","ordernummer":"FTP-202604081156","isbn":"978-90-8590-064-1","doi_nummer":"","naam_universiteit":"Universiteit Maastricht","afbeeldingen":13112,"naam_student:":"","binnenwerk":"","universiteit":"Universiteit Maastricht","cover":"","afwerking":"","cover_afwerking":"","design":""},"_links":{"self":[{"href":"https:\/\/www.proefschriftmaken.nl\/en\/wp-json\/wp\/v2\/us_portfolio\/9757","targetHints":{"allow":["GET"]}}],"collection":[{"href":"https:\/\/www.proefschriftmaken.nl\/en\/wp-json\/wp\/v2\/us_portfolio"}],"about":[{"href":"https:\/\/www.proefschriftmaken.nl\/en\/wp-json\/wp\/v2\/types\/us_portfolio"}],"author":[{"embeddable":true,"href":"https:\/\/www.proefschriftmaken.nl\/en\/wp-json\/wp\/v2\/users\/8"}],"replies":[{"embeddable":true,"href":"https:\/\/www.proefschriftmaken.nl\/en\/wp-json\/wp\/v2\/comments?post=9757"}],"version-history":[{"count":1,"href":"https:\/\/www.proefschriftmaken.nl\/en\/wp-json\/wp\/v2\/us_portfolio\/9757\/revisions"}],"predecessor-version":[{"id":9760,"href":"https:\/\/www.proefschriftmaken.nl\/en\/wp-json\/wp\/v2\/us_portfolio\/9757\/revisions\/9760"}],"wp:featuredmedia":[{"embeddable":true,"href":"https:\/\/www.proefschriftmaken.nl\/en\/wp-json\/wp\/v2\/media\/13112"}],"wp:attachment":[{"href":"https:\/\/www.proefschriftmaken.nl\/en\/wp-json\/wp\/v2\/media?parent=9757"}],"wp:term":[{"taxonomy":"us_portfolio_category","embeddable":true,"href":"https:\/\/www.proefschriftmaken.nl\/en\/wp-json\/wp\/v2\/us_portfolio_category?post=9757"}],"curies":[{"name":"wp","href":"https:\/\/api.w.org\/{rel}","templated":true}]}}