{"id":8071,"date":"2026-04-03T11:03:31","date_gmt":"2026-04-03T11:03:31","guid":{"rendered":"https:\/\/www.proefschriftmaken.nl\/portfolio\/jorge-armero-gimenez\/"},"modified":"2026-04-23T09:04:02","modified_gmt":"2026-04-23T09:04:02","slug":"jorge-armero-gimenez","status":"publish","type":"us_portfolio","link":"https:\/\/www.proefschriftmaken.nl\/en\/portfolio\/jorge-armero-gimenez\/","title":{"rendered":"Jorge Armero Gimenez"},"content":{"rendered":"","protected":false},"excerpt":{"rendered":"","protected":false},"author":8,"featured_media":14142,"comment_status":"closed","ping_status":"closed","template":"","meta":{"_acf_changed":false,"footnotes":""},"us_portfolio_category":[45],"class_list":["post-8071","us_portfolio","type-us_portfolio","status-publish","has-post-thumbnail","hentry","us_portfolio_category-new-template"],"acf":{"naam_van_het_proefschift":"ALiCE's adventures in Vaccinialand","samenvatting":"Er is geen Nederlandse samenvatting beschikbaar. De Engelse samenvatting vind je <a href=\"https:\/\/www.proefschriftmaken.nl\/en\/portfolio\/jorge-armero-gimenez\/\">hier<\/a>.","summary":"Human history is tightly connected to our interaction with other organisms, most notably pathogens. Ever-present diseases such as polio and cholera, or epidemic and pandemic agents such as Yersinia pestis and influenza viruses have had a great impact on the quality of human life and how our societies developed. The combined scientific efforts over several centuries have led to the development of numerous methods to combat these pathogenic agents, with vaccines proving to be the most effective. A wide diversity of vaccine types exists nowadays, each having their advantages and shortcomings. Among them, virus-like particles (VLPs) represent a very promising vaccination platform, given their high immunogenicity and safety. However, methods for expedited VLP vaccine development and manufacture are required in the event of a novel epidemic or pandemic threat (e.g. SARS-CoV-2).\n\nCurrent cell-based platforms for VLP manufacture show limitations in key areas critical for pandemic preparedness, including high-throughput candidate screening, scalability, speed, and flexibility. For this reason, in this thesis we investigated the use of a novel BY-2 tobacco-based cell-free protein synthesis (CFPS) system (BYL, commercialized as ALiCE\u00ae) as a tool for pandemic preparedness. In Chapter 2, we investigated the use of BYL to quickly screen different chimeric variants of a hepatitis B core (HBc) virus-like particle (VLP). The open reaction conditions of BYL enabled the expedited expression and assembly analysis of different HBc-based chimeric VLPs. We observed that the inclusion of the C-terminal domain (CTD) of the HBc VLP increased particle stability, at the expense of lower acceptability of foreign inserts at the major immunomodulatory region. The scalability of HBc VLP production in BYL was also tested, showing linear scale-up to 1L without losses in protein yield. Produced VLPs were promptly recognized and internalized by immature dendritic cells and triggered a pro-inflammatory response when exposed to human peripheral blood mononuclear cells. These results thus indicate the applicability of BYL-produced HBc VLPs as vaccines.\n\nIn vaccine manufacture, the establishment of efficient and scalable purification processes is a mandatory step to generate cost-effective vaccine candidates. In Chapter 3 we studied the application of different workflows for the purification of HBc VLP-based vaccines produced in BYL. Hydrophobic interaction, rather than ion exchange chromatography, was shown as an efficient method to purify HBc VLPs, reflecting on the intrinsic hydrophobicity of the HBc particles. The previously used heat-treatment clarification step was effectively replaced by a more scalable multimodal chromatography process. Lastly, the affinity-based purification of HBc VLPs under denaturing conditions allowed the purification of HBc VLPs carrying non-canonical amino acids which altered their purification properties. These results thus show the drastic effects that small insertions can have on multimeric protein structures regarding their interaction with chemical groups used for purification. The development of these purification methods also highlighted key characteristics that need to be addressed when purifying proteins from BYL, including the presence of large nucleic acid molecules and phenolic compounds.\n\nThe introduction of non-canonical amino acids (ncaas) can be utilized to further enhance the flexibility of VLP-based vaccines. Ncaas consist of amino acids carrying active chemical groups that provide added functionalities to the proteins in which they are incorporated. By incorporating reactive orthogonal handles to a VLP and its conjugation partner (e.g. a complex antigen), a post-assembly conjugation reaction can be performed. The post-assembly conjugation to VLPs thus allows their modification with complex antigenic structures that would not have been possible via protein fusion. In Chapter 4, we investigated ncaa incorporation in BYL to introduce orthogonal reactive conjugation handles into the HBc VLP and the receptor binding domain (RBD) from influenza hemagglutinin. For that purpose, different amber suppression systems were tested, from which the Escherichia coli tyrosine transferase showed the highest ncaa incorporation yields. The pyrrolysine amber suppression systems from Methanosarcina mazei and Methanosarcina barkeri showed very low ncaa incorporation yields, even when the transferase was exogenously produced and supplemented to BYL reactions. Click-mediated conjugation of ncaa-modified RBD to HBc VLPs produced in BYL resulted in fully formed, structurally sound HBc VLPs with active influenza RBDs on the surface.\n\nIn vaccine development, the possibility to test and produce different vaccine candidates in parallel is of great importance. Notably, high-throughput screening (HTS) of different vaccine candidates can expedite development during a pandemic, especially when there is no available information on the viability, structure, immunogenicity, or producibility of antigens from the pathogen for vaccination. In Chapter 5, the applicability of BYL for HTS was further studied. We analysed the application of different genetic templates for expression in BYL to enable the utilization of faster in vitro genetic construct designs. This showed that the utilization of protection against exonucleases was mandatory for expression in BYL. Linear DNA templates showed overall lower yields than plasmids, possibly due to lower transcription yields and\/or RNA stability. Additionally, we developed a novel circularization strategy that makes use of a cycling reaction and a thermostable ligase, which rapidly generated templates for BYL expression that do not show a reduction in yield. Lastly, studies into T7 activity and transcription within BYL were performed that show that pyrophosphatase activity is not a key factor affecting BYL yield. These results will help optimize expression when using alternative DNA templates in BYL and thus in its application for HTS.\n\nAltogether, this thesis shows the potential of the BYL CFPS system for the screening and scaled manufacture of VLP-based vaccines. The utilization of the HBc VLP, together with the incorporation of ncaa and high-throughput screening sets the groundwork required to apply BYL as a pandemic preparedness platform for expedited candidate vaccine development.\n\nResumen\n\nLa historia de la humanidad est\u00e1 profundamente interconectada con nuestra interacci\u00f3n con diversos organismos, especialmente los microorganismos pat\u00f3genos. Entre enfermedades que nos han acompa\u00f1ado pr\u00e1cticamente desde los anales de la historia, como la viruela o el c\u00f3lera, y brotes epid\u00e9micos o pand\u00e9micos como la peste negra y la gripe, el impacto de los pat\u00f3genos en la calidad de vida y en el desarrollo de nuestra sociedad ha sido muy marcado. A lo largo de varios siglos, grandes avances en la ciencia y medicina han dado lugar al desarrollo de diferentes herramientas para combatir a los pat\u00f3genos, con las vacunas siendo las m\u00e1s efectivas. Una gran diversidad de vacunas existe hoy en d\u00eda, con cada una teniendo sus propias caracter\u00edsticas positivas y negativas. Entre ellas, las part\u00edculas similares a virus (o VLP en ingl\u00e9s) poseen un gran potencial, dada su gran inmunogenicidad y seguridad. Aun as\u00ed, m\u00e9todos para desarrollar y producir r\u00e1pidamente vacunas basadas en la tecnolog\u00eda de VLP son necesarios para poder ser implementadas en el caso que surja una nueva epidemia o pandemia (p. ej. SARS-CoV-2).\n\nLos m\u00e9todos actuales de producci\u00f3n de vacunas se basan mayoritariamente en el uso de c\u00e9lulas, las cuales poseen demasiadas limitaciones a la hora de ser utilizadas durante una pandemia, incluyendo bajas posibilidades de paralelizaci\u00f3n, escalabilidad, rapidez y flexibilidad. Por esta raz\u00f3n, en esta tesis hemos investigado la utilizaci\u00f3n de un novedoso sistema de s\u00edntesis de prote\u00ednas sin c\u00e9lulas (CFPS) a base de tabaco (BYL, comercializado como ALiCE\u00ae) como una herramienta de preparaci\u00f3n a las pandemias. En el segundo cap\u00edtulo de esta tesis, hemos utilizado BYL para estudiar y producir r\u00e1pidamente diferentes variantes quim\u00e9ricas del VLP basado en el n\u00facleo del virus de la hepatitis B (HBc). La caracter\u00edstica reacci\u00f3n abierta del CFPS permiti\u00f3 la r\u00e1pida expresi\u00f3n y an\u00e1lisis del ensamblaje de 6 diferentes HBc VLPs. De esta manera elucidamos que el dominio de prote\u00edna C-terminal del HBc VLP incrementa la estabilidad de la part\u00edcula, a cambio de una menor aceptabilidad de inserci\u00f3n en la regi\u00f3n inmunomoduladora mayor. La escalabilidad de la producci\u00f3n de HBc VLPs en BYL tambi\u00e9n fue analizada, demostrando una relaci\u00f3n lineal hasta 1L sin p\u00e9rdidas en el rendimiento de producci\u00f3n. Los VLPs producidos en BYL fueron reconocidos e internalizados por c\u00e9lulas dendr\u00edticas inmaduras, y tambi\u00e9n produjeron una respuesta proinflamatoria cuando fueron expuestos a c\u00e9lulas mononucleares de sangre perif\u00e9rica, as\u00ed probando la inmunogenicidad de esta vacuna. Estos resultados indican la aplicabilidad de BYL para producir vacunas basadas en el HBc VLP.\n\nEn la producci\u00f3n industrial de vacunas, el establecimiento de procesos de purificaci\u00f3n eficientes y escalables es un proceso obligatorio para poder generar vacunas de manera econ\u00f3mica. En el tercer cap\u00edtulo, hemos estudiado la aplicaci\u00f3n de diferentes procesos de purificaci\u00f3n para HBc VLPs producidos en BYL. Cromatograf\u00eda de interacci\u00f3n hidrof\u00f3bica, y no de intercambio de iones, pudo purificar eficientemente HBc VLPs, lo cual refleja la naturaleza hidrof\u00f3bica de estas part\u00edculas. Cromatograf\u00eda multimodal pudo ser utilizada para reemplazar el tratamiento t\u00e9rmico para la clarificaci\u00f3n previa a la cromatograf\u00eda. Finalmente, la aplicaci\u00f3n de cromatograf\u00eda de afinidad bajo condiciones desnaturalizantes permiti\u00f3 la purificaci\u00f3n de HBc VLPs que incorporaban amino\u00e1cidos no can\u00f3nicos, los cuales modificaron las propiedades de purificaci\u00f3n. Estos resultados demuestran el efecto dr\u00e1stico que peque\u00f1as inserciones pueden tener en estructuras multim\u00e9ricas, especialmente en su interacci\u00f3n con los grupos presentes en las resinas de purificaci\u00f3n. El desarrollo de estos procesos de purificaci\u00f3n tambi\u00e9n elucid\u00f3 caracter\u00edsticas clave que han de tenerse en cuenta en la purificaci\u00f3n de prote\u00ednas producidas en BYL, como la presencia de \u00e1cidos nucleicos y compuestos fen\u00f3licos.\n\nLa introducci\u00f3n de amino\u00e1cidos no can\u00f3nicos (ncaas) puede ser utilizada para aumentar la flexibilidad de vacunas basadas en VLPs. Ncaas son amino\u00e1cidos que poseen grupos reactivos que proveen nuevas funcionalidades a las prote\u00ednas en las cuales son introducidos. Incorporando grupos reactivos ortogonales a un VLP y su pareja de conjugaci\u00f3n (p.ej. un ant\u00edgeno), una conjugaci\u00f3n post-ensamblaje puede ser realizada. La conjugaci\u00f3n post-ensamblaje de VLPs permite su modificaci\u00f3n con ant\u00edgenos complejos, los cuales no podr\u00edan haber sido incorporados mediante fusi\u00f3n. En el cuarto cap\u00edtulo, investigamos la incorporaci\u00f3n de ncaa en BYL para introducir dichos grupos de conjugaci\u00f3n ortogonal en el HBc VLP y el dominio de uni\u00f3n al receptor (RBD) de la hemaglutinina de la gripe. Varios sistemas de supresi\u00f3n \u00e1mbar fueron probados, de los cuales el sistema de transferencia de tirosina de Escherichia coli demostr\u00f3 los mayores rendimientos de introducci\u00f3n de ncaa, mientras que los sistemas de transferencia de pirrolisina de Methanosarcina mazei y Methanosarcina barkeri dieron muy bajos rendimientos, incluso cuando la transferasa fue producida y suplementada a las reacciones de BYL. La reacci\u00f3n de conjugaci\u00f3n click entre proteinas RBD y HBc VLPs producidos en BYL que conten\u00edan ncaa result\u00f3 en estructuras estables, manteniendo la actividad de cada miembro de la conjugaci\u00f3n.\n\nEn el desarrollo de vacunas, la posibilidad de investigar y producir diferentes candidatos en paralelo es muy importante. Notablemente, el cribado de alto rendimiento (CAR) de diferentes candidatos de vacunas durante una pandemia puede incrementar la velocidad de desarrollo radicalmente, especialmente cuando no existe informaci\u00f3n previa sobre la viabilidad, estructura, inmunogenicidad o producibilidad de los ant\u00edgenos del pat\u00f3geno usados para la vacunaci\u00f3n. En el quinto cap\u00edtulo, la aplicabilidad de BYL en CAR fue estudiada. Para ello, la utilizaci\u00f3n de diferentes formatos de plantillas gen\u00e9ticas fue estudiada para permitir la utilizaci\u00f3n de procesos de construcci\u00f3n gen\u00e9tica in vitro m\u00e1s veloces. Nuestra investigaci\u00f3n demostr\u00f3 la necesidad de utilizaci\u00f3n de protecci\u00f3n contra exonucleasas en BYL. La utilizaci\u00f3n de plantillas de ADN lineares result\u00f3 en menores rendimientos que los pl\u00e1smidos, posiblemente debido a un menor rendimiento de transcripci\u00f3n y\/o menor estabilidad del ARN generado. Adicionalmente desarrollamos un nuevo proceso de circularizaci\u00f3n utilizando una reacci\u00f3n c\u00edclica y una ligasa termoestable, permitiendo la r\u00e1pida generaci\u00f3n de plantillas para expresi\u00f3n en BYL sin una reducci\u00f3n en la productividad. Finalmente, tambi\u00e9n estudiamos la actividad de la transcriptasa T7 en BYL, revelando que la actividad de la pirofosfatasa no es esencial en el rendimiento de BYL. Estos resultados ayudar\u00e1n en la optimizaci\u00f3n de la expresi\u00f3n cuando se utilicen plantillas de ADN alternativas en BYL, y, por ende, en su aplicaci\u00f3n para aplicaciones CAR.\n\nEn conclusi\u00f3n, esta tesis demuestra el potencial del sistema BYL de CFPS para la investigaci\u00f3n y producci\u00f3n de vacunas basadas en VLPs. La utilizaci\u00f3n del HBc VLP, en conjunto con la incorporaci\u00f3n de ncaa y CAR establece las bases requeridas para la aplicaci\u00f3n de BYL como una plataforma de preparaci\u00f3n para pandemias y r\u00e1pido desarrollo de vacunas.","auteur":"Jorge Armero Gimenez","auteur_slug":"jorge-armero-gimenez","publicatiedatum":"21 februari 2025","taal":"EN","url_flipbook":"https:\/\/ebook.proefschriftmaken.nl\/ebook\/jorgearmerogimenez?iframe=true","url_download_pdf":"","url_epub":"","ordernummer":"FTP-202604031100","isbn":"","doi_nummer":"","naam_universiteit":"Wageningen University","afbeeldingen":14142,"naam_student:":"","binnenwerk":"","universiteit":"Wageningen University","cover":"","afwerking":"","cover_afwerking":"","design":""},"_links":{"self":[{"href":"https:\/\/www.proefschriftmaken.nl\/en\/wp-json\/wp\/v2\/us_portfolio\/8071","targetHints":{"allow":["GET"]}}],"collection":[{"href":"https:\/\/www.proefschriftmaken.nl\/en\/wp-json\/wp\/v2\/us_portfolio"}],"about":[{"href":"https:\/\/www.proefschriftmaken.nl\/en\/wp-json\/wp\/v2\/types\/us_portfolio"}],"author":[{"embeddable":true,"href":"https:\/\/www.proefschriftmaken.nl\/en\/wp-json\/wp\/v2\/users\/8"}],"replies":[{"embeddable":true,"href":"https:\/\/www.proefschriftmaken.nl\/en\/wp-json\/wp\/v2\/comments?post=8071"}],"version-history":[{"count":1,"href":"https:\/\/www.proefschriftmaken.nl\/en\/wp-json\/wp\/v2\/us_portfolio\/8071\/revisions"}],"predecessor-version":[{"id":8072,"href":"https:\/\/www.proefschriftmaken.nl\/en\/wp-json\/wp\/v2\/us_portfolio\/8071\/revisions\/8072"}],"wp:featuredmedia":[{"embeddable":true,"href":"https:\/\/www.proefschriftmaken.nl\/en\/wp-json\/wp\/v2\/media\/14142"}],"wp:attachment":[{"href":"https:\/\/www.proefschriftmaken.nl\/en\/wp-json\/wp\/v2\/media?parent=8071"}],"wp:term":[{"taxonomy":"us_portfolio_category","embeddable":true,"href":"https:\/\/www.proefschriftmaken.nl\/en\/wp-json\/wp\/v2\/us_portfolio_category?post=8071"}],"curies":[{"name":"wp","href":"https:\/\/api.w.org\/{rel}","templated":true}]}}