{"id":7740,"date":"2026-04-03T07:27:18","date_gmt":"2026-04-03T07:27:18","guid":{"rendered":"https:\/\/www.proefschriftmaken.nl\/portfolio\/jasmine-bracher\/"},"modified":"2026-04-23T09:16:42","modified_gmt":"2026-04-23T09:16:42","slug":"jasmine-bracher","status":"publish","type":"us_portfolio","link":"https:\/\/www.proefschriftmaken.nl\/en\/portfolio\/jasmine-bracher\/","title":{"rendered":"Jasmine Bracher"},"content":{"rendered":"","protected":false},"excerpt":{"rendered":"","protected":false},"author":8,"featured_media":14349,"comment_status":"closed","ping_status":"closed","template":"","meta":{"_acf_changed":false,"footnotes":""},"us_portfolio_category":[45],"class_list":["post-7740","us_portfolio","type-us_portfolio","status-publish","has-post-thumbnail","hentry","us_portfolio_category-new-template"],"acf":{"naam_van_het_proefschift":"Engineering of metabolism and membrane transport in Saccharomyces cerevisiae for improved industrial performance","samenvatting":"In 2017 tekenden bijna 200 partijen het klimaatakkoord in Parijs waarmee zij zich committeerden aan het doel om de gemiddelde wereldwijde temperatuurstijging onder de 2 graden te houden. Bijna alle mogelijke scenario\u2019s die gebaseerd zijn op dit doel omvatten een sterke toename in het gebruik van biobrandstof voor transport ter land, ter zee en in lucht. In tegenstelling tot fossiele brandstof maken biobrandstoffen, in principe, een gesloten koolstofcyclus mogelijk. De biobrandstof ethanol wordt gevormd door microbi\u00eble vergisting van plantaardig zetmeel, rietsuiker of reststromen uit de landbouw. Deze vloeibare brandstof is een direct implementeerbaar alternatief voor fossiele brandstof, omdat het de voordelen van duurzame brandstofproductie combineert met toepasbaarheid in bestaande verbrandingsmotoren zonder dat hiervoor dure modificaties van de huidige brandstofinfrastructuur nodig zijn.\n\nMomenteel is bioethanol, binnen de industri\u00eble biotechnologie, het product dat met het grootste volume geproduceerd wordt. 99% van deze ethanol wordt geproduceerd in zogenaamde \u201ceerste generatie\u201d-processen waarin bakkersgist (Saccharomyces cerevisiae) de koolhydraten uit suikerriet of mais fermenteert. \u201cTweede generatie\u201d bioethanol, waarvoor de eerste fabrieken op industri\u00eble schaal nu worden gestart, wordt gemaakt door vergisting van suikers die afkomstig zijn van lignocellulose-bevattende plantaardige biomassa. Deze biomassa is afkomstig van landbouwafval zoals tarwestro en suikerbietenpulp en maakt een \u201cvoedsel en brandstof\u201d scenario mogelijk. De industri\u00eble implementatie van deze processen brengt echter wel uitdagingen met zich mee voor de gist en voor biotechnologen. Hydrolyse van lignocellulose-bevattende biomassa levert een mengsel van suikers afkomstig van cellulose en hemicellulose, maar ook verbindingen die de groei en levensvatbaarheid van S. cerevisiae negatief be\u00efnvloeden.\n\nQua suikersamenstelling bevat de gehydrolyseerde lignocellulose, naast glucose, ook 30% d-xylose en 2 \u2013 20% l-arabinose. Wildtype stammen van S. cerevisiae zijn niet in staat de pentoses d-xylose en l-arabinose te fermenteren. Daarom heeft internationaal onderzoek zich in de afgelopen twee decennia gericht op strategie\u00ebn waarbij de stofwisseling van S. cerevisiae zo wordt aangepast dat de ana\u00ebrobe omzetting van d-xylose en l-arabinose naar ethanol mogelijk wordt. Een combinatie van genetische aanpassingen van S. cerevisiae geeft deze gist het vermogen de genoemde pentoses om te zetten. Hiervoor moeten stofwisselingsroutes gebaseerd op d-xylose- en l-arabinose-isomerase, afkomstig uit andere schimmels en bacteri\u00ebn, gecombineerd worden met het tot overexpressie brengen van het niet-oxidatieve gedeelte van de pentosefosfaatroute en deletie van het niet-specifieke aldose-reductasegen GRE3. Ontwikkelingen in methoden om de stofwisseling van gist aan te passen, zoals het aanpassen van het genoom met behulp van CRISPR-Cas9, hebben de constructie en het karakteriseren van S. cerevisiae stammen waarin de kinetiek, robuustheid en ethanolopbrengst in tweede-generatie processen zijn verbeterd, mogelijk gemaakt. \n\nHOOFSTUK 1 van dit proefschrift vat de geschiedenis en recente vooruitgang in het aanpassen van de stofwisseling van S. cerevisiae van productie van ethanol samen vanuit een academisch en industrieel perspectief. \n\nOpname van glucose door S. cerevisiae is effici\u00ebnt en omvat een complexe regulatie van genen en de in vivo activiteit van 20 hexose-transporteiwitten. Deze transporteiwitten hebben een brede reikwijdte in affiniteit voor glucose en het vermogen om op verschillende concentraties van glucose te reageren. Hoewel een vergelijkbaar systeem voor de opname van pentoses niet is ge\u00ebvolueerd in S. cerevisiae, hebben verschillende hexosetransport-eiwitten ook affiniteit voor d-xylose en maken transport van deze pentose mogelijk. l-arabinose transport is daarentegen vooral afhankelijk van \u00e9\u00e9n galactose-transporteiwit, Gal2. Dit transporteiwit heeft een lage affiniteit voor l-arabinose en de expressie van GAL2 wordt sterk onderdrukt door glucose, dat veel voorkomt in gehydrolyseerd lignocellulose. Glucose is hierdoor een sterke en industrieel relevante remmer van l-arabinose opname door Gal2. De combinatie van lage affiniteit en repressie door glucose leidt tot een langere fermentatietijd, omdat hierdoor eerst glucose en dan pas l-arabinose opgenomen wordt. Dit wordt met name aan het einde van fermentatieprocessen duidelijk door een \u201cnaijleffect\u201d dat zichtbaar een langzame afname van de l-arabinoseconcentratie. Dit naijleffect heeft negatieve gevolgen voor de productiviteit van de ethanol productie. \n\nDe doelstelling van HOOFDSTUK 2 van dit proefschrift was het verbeteren van de affiniteit van l-arabinose transport in genetisch aangepaste, l-arabinosefermenterende S. cerevisiae -stammen. Door het analyseren van transcriptoomdata van Penicillium chrysogenum, gekweekt in een chemostaat met l-arabinose als limiterend substraat, konden kandidaat-transporteiwitten voor deze suiker ge\u00efdentificeerd worden. De op deze manier ge\u00efdentificeerde genen werden elk tot expressie gebracht in een S. cerevisiae-stam waarin GAL2 was verwijderd, waardoor onderzocht kon worden welke van de genen groei op l-arabinose mogelijk maakten. In tegenstelling tot Gal2 gaf het Penicillium-transporteiwit PcAraT, de mogelijkheid om l-arabinose op te nemen in de aanwezigheid van glucose. Hierdoor konden, in theorie, deze twee suikers gelijktijdig gefermenteerd worden. Opname-experimenten met radioactief gemerkte suikers toonden aan dat PcAraT een zeer hoge affiniteit voor l-arabinose had en dat dit eiwit geen glucose of d-xylose transporteerde. De residuele l-arabinoseconcentratie in chemostaatcultures was vierhonderdvijftig keer lager voor stammen die PcAraT tot expressie brachten dan voor vergelijkbare stammen die l-arabinose alleen konden transporteren via Gal2. Deze waarneming ondersteunde de experimenten met radioactieve suikers en bevestigde dat PcAraT een bijdrage kan leveren aan de constructie van nieuwe l-arabinose-fermenterende S. cerevisiae stammen. De introductie van PcAraT in S. cerevisiae zorgde voor een glucose-ongevoelige l-arabinose-opname met een hoge affiniteit, die vooral relevant is om de residuele l-arabinose aan het einde van een fermentatie op te nemen. Echter, expressie van PcAraT maakte geen snel transport van l-arabinose mogelijk. Het endogene galactosetransporteiwit Gal2 kan l-arabinose wel snel transporteren, maar de expressie van Gal2 wordt onderdrukt door glucose. \n\nHet doel van HOOFDSTUK 3 van dit proefschrift was het verbeteren van de capaciteit van genetisch aangepaste, l-arabinose consumerende, S. cerevisiae om l-arabinose te transporteren. Hierbij werd gebruik gemaakt van glucose-xylose-arabinose medium om gelijktijdige fermentatie van deze suikers en, uiteindelijk, een afname van de totale fermentatietijd mogelijk te maken. Hiervoor werd S. cerevisiae stam gemaakt die PcAraT tot expressie bracht maar geen glucose kon fosforyleren, waardoor deze stam glucose kon opnemen maar niet verder kon omzetten. Door evolutie in het laboratorium, waarbij gebruik werd gemaakt van een sequenti\u00eble ana\u00ebrobe batchcultures op glucose-xylose-arabinose medium, kon geselecteerd worden op cellen die l-arabinose konden opnemen in de aanwezigheid van een hoge concentratie van de andere suikers. Na \u2018whole genome sequencing\u2019 werden duplicaties van het gen voor de GAL2 transporteiwit en verschillende mutaties binnen dit gen aangetroffen in onafhankelijk ge\u00ebvolueerde cellijnen. De relevantie van individuele mutaties werd onderzocht door deze ongedaan te maken in de verschillende ge\u00ebvolueerde stammen en door deze mutaties in de wildtype stam te introduceren. Daarnaast werd transport kwantitatief bestudeerd met radioactief gemerkte suikers. Alleen Duplicatie van Gal2 was niet voldoende om directe ana\u00ebrobe groei op l-arabinose mogelijk te maken, maar een aantal mutaties resulteerde in Gal2 varianten met verbeterd l-arabinosetransport. Het allel GAL2N371T, T89I codeerde voor een glucose-onafhankelijk l-arabinose transport en leidde tot verlies van glucosetransport. Een tweede ge\u00ebvolueerd allel, GAL2N376T, had een verhoogde l-arabinosetransportcapaciteit, die ten koste ging van de capaciteit om glucose te transporteren. Een derde allel, GAL2T89I, had een verlaagde affiniteit voor glucose terwijl de algehele affiniteit voor l-arabinose groter geworden was. Deze veranderingen gingen ten koste van de capaciteit om beide suikers te transporteren. Toen dit allel werd vervangen door een wildtype allel, verdubbelde de fermentatietijd van 20 g L-1 l-arabinose in het glucose-arabinose-xylose medium (van 25 naar 45 uur). Deletie van PcAraT in dezelfde stam verlaagde de groeisnelheid van 0.12 uur-1 tot 0.1 uur-1, waardoor de totale fermentatietijd toenam. Met de ontdekking en functionele expressie van PcAraT in S. cerevisiae en de selectie voor en karakterisering van de gemuteerde Gal2-allelen met \u2013verbeterde l-arabinose\u2013 transport in de aanwezigheid van glucose, zijn belangrijke elementen geleverd voor een verbeterde fermentatie van l-arabinose en de productie van nieuwe giststammen voor 2de generatie bioethanolproductie. \n\nOmdat de suikers uit lignocellulose biomassa voor 30% bestaan uit d-xylose, is de ana\u00ebrobe vergisting van deze suiker essentieel voor een productief economisch proces. Het is daarom niet verrassend dat een significant gedeelte van het onderzoek naar het gebruik van S. cerevisiae in de bioethanolproductie zich heeft gericht op ana\u00ebrobe fermentatie van d-xylose. Publicaties over d-xylosefermenterende S. cerevisiae-stammen die xylose-isomerase tot expressie brengen, komen tot tegenstrijdige conclusies over de noodzaak van evolutie in het laboratorium om ana\u00ebrobe groei op d-xylose mogelijk te maken. Twee publicaties van de Industri\u00eble Microbiologie-groep van de TU Delft, die dezelfde stam en vergelijkbare genetische modificaties gebruikten, rapporteerde in een studie directe ana\u00ebrobe groei op xylose terwijl in de andere studie evolutie en een additionele mutatie nodig waren om ana\u00ebrobe groei op deze pentose mogelijk te maken.\n\nIn HOOFDSTUK 4 van dit proefschrift zijn de vereisten voor ana\u00ebrobe groei op d-xylose van gemodificeerde S. cerevisiae-stammen met een CEN.PK achtergrond, opnieuw onder de loep genomen. De reconstructie van de stammen met het vermogen tot vergisting van d-xylose resulteerde in de identificatie van subtiele verschillen in de gebruikte kweekmethoden, die grote gevolgen hadden voor ana\u00ebrobe groei. Vooral de dichtheid waarmee een culture ge\u00ebnt bleek hierbij van groot belang. Als een entdichtheid van 0.2 g biomassa L-1 gebruikt werd, begon de cultuur direct te groeien terwijl het 7\u20138 dagen durende voordat een cultuur met een entdichtheid van 0.02 g biomassa L-1 begon te groeien. Door het doorleiden van met CO2 verrijkt stikstofgas door cultures met een lage entdichtheid culture kon de initi\u00eble, hogere, CO2- concentratie in cultures met een hoge entdichtheid gesimuleerd worden. In deze cultures, en ook in cultures waarin l-aspartaat in plaats van ammonium als stikstofbron werd gebruikt, begon ana\u00ebrobe groei vrijwel meteen Ook kon door het weglaten van overexpressiecassettes voor NQM1 en TKL2, twee paralogen van pentosefosfaatroutegenen, kon een genetisch aangepaste stam geconstrueerd worden die direct d-xylose begon te fermenteren bij een lage entdichtheid, zelfs wanneer de reactor met puur stikstofgas doorborreld werd. Deze waarnemingen losten de schijnbare tegenstellingen in de literatuur op over strategie\u00ebn om met genetische aanpassingen S. cerevisiae anaeroob d-xylose te laten fermenteren. Daarnaast vergrootten deze resultaten de kennis over de mogelijke relevantie van de beschikbaarheid van CO2 en anaplerotische carboxyleringsreacties op anaerobe d-xylose-fermentatie door genetisch gemodificeerde S. cerevisiae-stammen. \n\nOm de standaardisering en reproduceerbaarheid van wetenschappelijke resultaten te bewaken, worden in zowel academische als industri\u00eble context, vitamines aan kweekmedia toegevoegd. Hiermee wordt limitatie van deze componenten tijdens de kweek van gist voorkomen. Onderzoek naar de precieze behoefte aan vitamines en prototrophie\u00ebn (het vermogen van de cel bepaalde vitamines te maken), kan de kosten van medium mogelijk significant verminderen. In het genoom van de laboratoriumstam S. cerevisiae CEN.PK113-7D kon de complete biosynthetische route voor de vitamine biotine synthese ge\u00efdentificeerd worden. Desondanks groeide deze stam heel slecht, met een bijna onmeetbaar lage snelheid, in medium zonder biotine. \n\nHOOFDSTUK 5 van dit proefschrift was ge\u00efnspireerd door een academische interesse om de nog onbekende aspecten van biotinesynthese in S. cerevisiae te ontrafelen. Daarnaast is een biotine-prototrofe stam vanuit zowel industrieel als academisch perspectief interessant. Door gebruik van parallelle sequenti\u00eble batchcultures en een accelerostaatregime in media zonder dit dure supplement, konden variantie van de CEN.PK113-7D-stam geselecteerd worden die snel groeiden in de afwezigheid van biotine. In de ge\u00ebvolueerde stammen werd met behulp van \u2018whole-genome-sequencing\u2019 en \u2018reverse metabolic engineering\u2019 een amplificatie van het gen BIO1 ge\u00efdentificeerd, die de verbeterde groei in medium zonder biotine grotendeels verklaarde. Deletie van genen die codeerden voor de transporteiwitten Tpo1 en\/of Pdr12, die ge\u00efnactiveerd waren in ge\u00ebvolueerde stammen, zorgde voor een verdere verbetering van de groei van stammen die BIO1 tot overexpressie brachten. De identificatie van kandidaat genen voor het maken van biotineprototrofe stammen in HOOFDSTUK 5 kan de kosten van veel biotechnologische producten positief be\u00efnvloeden en toekomstige onderzoekers inspireren de gebruikte methoden in te zetten voor andere dure mediumsupplementen.","summary":"Nearly 200 parties signed and committed to the Paris agreement in 2017, which comprises the long-term goal to keep the average global temperature increase well below 2 degrees above pre-industrial levels. Virtually all possible scenarios drafted to reach this goal include a strongly increased use of biofuels for transport by land, sea and air. Bioethanol, whose production could, in principle and in contrast to fossil fuel production, involve a closed carbon cycle, is generated by microbial fermentation of sugars from plant-derived starch or agricultural waste. This liquid transport fuel provides a readily implementable alternative to fossil fuels as it combines the advantages of sustainable fuel production and compatibility with existing combustion engine technologies, without a requirement for time-consuming and expensive changes in our current infrastructure. \n\nTo date, bioethanol is the largest volume product of industrial biotechnology. 99% of this ethanol is generated via 1st generation processes, largely derived by fermentation of hydrolysed sugar cane or corn starch by bakers\u2019 yeast (Saccharomyces cerevisiae). So-called \u20182nd generation\u2019 bioethanol, for which the first commercial-scale plants are now starting up, is made by fermentation of sugars present in lignocellulosic biomass, typically harvested from agricultural waste streams, such as wheat straw or sugar beet pulp. Whilst such feedstocks enable a \u201cfood and fuel\u201d scenario, their industrial implementation brings along additional challenges for yeasts and biotechnologists. Hydrolysis of lignocellulosic biomass, in particular the cellulose and hemicellulose fractions, releases a mixture of different sugars as well as inhibiting compounds that impair growth and viability of S. cerevisiae. Whilst glucose is the most abundant fermentable carbon source, the pentose sugar d-xylose can cover up to 30% of the total sugar content. The fraction of the pentose l-arabinose typically varies between 2 \u2013 20%, depending on the feedstock used. Although pentose sugars cannot be fermented to ethanol by wild-type S. cerevisiae strains, international research efforts over the past two decades yielded metabolic engineering strategies to enable anaerobic conversion of d-xylose and l-arabinose to ethanol by S. cerevisiae.\n\nThe expression of heterologous, d-xylose- and l-arabinose-isomerase based pathways from fungi or bacteria, together with over-expression of genes of the non-oxidative pentose phosphate pathway (PPP) and deletion of the unspecific aldose-reductase gene GRE3 within S. cerevisiae allows this yeast to aerobically metabolize both sugars. The recent advances in metabolic engineering tools, such as CRISPR-Cas9-assisted genome editing, greatly advanced the construction and characterization of metabolically engineered S. cerevisiae strains with improved yields, kinetics and robustness in 2nd generation ethanol production processes. \n\nCHAPTER 1 of this thesis summarizes the history and recent advances in metabolic engineering of S. cerevisiae for the production of bioethanol from an academic and industrial perspective. \n\nCellular uptake of the native substrate glucose by S. cerevisiae is highly efficient and involves complex regulation of the expression levels and in vivo activities of 20 hexose transporters, which together offer an adaptable range of transport affinities and capacities suited for various extracellular glucose levels. A similar system for the uptake of pentose sugars has not evolved within S. cerevisiae. Whilst d-xylose can enter the cells via multiple hexose transporters, l-arabinose transport depends on the single galactose transporter Gal2, which however exhibits a low affinity for l-arabinose and whose expression is strongly repressed by glucose, which is abundantly present in lignocellulosic hydrolysates. Hence, glucose is a potent competitive inhibitor of l-arabinose transport via Gal2. The combination of both characteristics delays the total fermentation time of a mix of glucose and l-arabinose due to sequential uptake of those sugars and causes a prominent \u201ctailing effect\u201d, reflected by very slowly decreasing l-arabinose concentrations towards the end of the fermentation. A low ethanol productivity, impairs inhibitor tolerance of the cells and negatively affects process economics. \n\nThe objective of CHAPTER 2 of this thesis was to increase the affinity of l-arabinose transport in engineered, l-arabinose fermenting S. cerevisiae strains. To this end, the analysis of chemostat-based transcriptome data of l-arabinose-grown Penicillium chrysogenum cultures yielded a selection of candidate l-arabinose transporter genes. Their separate expression in an engineered S. cerevisiae strain lacking GAL2, and growth tests on l-arabinose led to the identification of one transporter that enabled growth within the described setting. In contrast to Gal2, this protein, termed PcAraT, was shown to allow l-arabinose transport even in presence of glucose, theoretically enabling co-fermentation of those two hydrolysate-borne carbon sources. Uptake experiments with radiolabelled sugars revealed a very high l-arabinose affinity of this proton-symporter and the absence of transport activity for both, glucose and xylose. Four hundred fifty-fold lower residual l-arabinose concentrations in chemostat cultures with engineered strains expressing PcAraT, as compared to similar strains expressing Gal2, corroborated those results and confirmed the value of PcAraT as a promising addition to engineered, l-arabinose fermenting S. cerevisiae strains. \n\nPcAraT conferred glucose-insensitive, high-affinity l-arabinose uptake which is specifically relevant for \u201cmopping up\u201d remaining l-arabinose towards the end of a fermentation. However, the transport capacity of this transporter alone did not allow fast consumption of high quantities of l-arabinose. The endogenous galactose transporter Gal2, confers l-arabinose transport with a satisfying transport capacity, but suffers from severe glucose repression. \n\nThe aim of CHAPTER 3 of this thesis was to improve l-arabinose transport capacity of engineered, l-arabinose consuming S. cerevisiae in glucose-xylose-arabinose media in order to allow co-fermentation and ultimately reduce total fermentation times of mixtures of those sugars. To this end, a glucose-phosphorylation-negative, PcAraT expressing, S. cerevisiae strain that could transport but not metabolize glucose, was generated and subjected to adaptive laboratory evolution in sequential anaerobic batch reactors. The latter contained glucose-xylose-arabinose media, thereby generating a selective advantage for cells capable of taking-up l-arabinose in presence of high concentrations of competing sugars. Whole- genome sequencing identified duplications of GAL2 as well as mutations within this gene in multiple independently evolved single-colony isolates. The relevance of individual mutations was assessed both via reversion to wild-type alleles in evolved strains and by introduction of mutations into the native parental strain, as well as by quantitative transport assays using radiolabeled sugars. Whilst the mutated GAL2 alleles revealed novel Gal2 characteristics in favour of l-arabinose transport, duplication of GAL2 alone was shown to, in itself, not confer instantaneous anaerobic growth on l-arabinose. However, transport assays with Gal2N376T,T89I revealed glucose-insensitive l-arabinose transport characteristics and showed that this transporter completely lost its ability to transport glucose. The transporter encoded by a second evolved allele, GAL2N376T, showed high l-arabinose transport capacities at the cost of reduced glucose transport abilities. Lastly, Gal2T89I showed a decreased glucose affinity while increasing overall l-arabinose affinity at the cost of transport capacity of both sugars. Restoring this allele to wild-type within an evolved strain nearly doubled the total fermentation time of 20 g L-1 l-arabinose within a glucose-arabinose-xylose mixture from 25 to 45 h. Deletion of PcAraT within the same evolved strain reduced overall growth rate from 0.12 h-1 to 0.1 h-1 and consequently increased the overall fermentation time. With the discovery and functional expression of PcAraT in S. cerevisiae, and the selection for and characterization of mutated Gal2 alleles with improved l-arabinose transport characteristics in presence of glucose, valuable elements for improved l-arabinose fermentation were provided for the generation of novel yeast strains for 2nd generation bioethanol production. \n\nWith d-xylose accounting for up to 30% of the total sugar content of lignocellulosic biomass, anaerobic fermentation of d-xylose is paramount to ensure an economically viable process. Not surprisingly, a significant part of the research effort to engineer S. cerevisiae for biofuel production has been dedicated to anaerobic d-xylose fermentation. Remarkably, reports on metabolic engineering of d-xylose-fermenting, xylose-isomerase based S. cerevisiae strains disagree as to whether extensive laboratory evolution is necessary to enable anaerobic growth on d-xylose or not. In particular, two previous publications from the TU Delft\u2019s industrial microbiology group, using the same laboratory strain and a similar metabolic engineering strategy, in one case reported instantaneous anaerobic xylose fermentation after targeted metabolic engineering while, in the second case, anaerobic growth on this pentose required anaerobic evolution and an additional mutation.\n\nThe objective of CHAPTER 4 of this thesis was to systematically reassess the genetic requirements for anaerobic growth on d-xylose of engineered, CEN.PK-derived S. cerevisiae strains. To this end, reconstruction of d-xylose-metabolizing strains allowed for the identification of subtle differences in cultivation procedures that strongly affected anaerobic growth. Inoculum density was found to be a particularly important factor. Cultures of a particular engineered strain inoculated with 0.2 g biomass L-1 readily picked up anaerobic growth on d-xylose upon inoculation of the anaerobic bioreactor while, at an inoculum density of 0.02 g biomass L-1, the same strain required an anaerobic lag phase of 7-8 d prior to initiation of anaerobic growth. Mimicking the higher initial CO2 concentrations in high-inoculum density cultures by sparging low-inoculum-density cultures with CO2-enriched nitrogen gas or by using l-aspartate instead of ammonium as nitrogen source, reproduced the phenotype of the former. Finally, omission of over-expression cassettes of the PPP paralogs NQM1 and TKL2 allowed the (re-)construction of a solely metabolically engineered strain that instantaneously fermented xylose when inoculated at low inoculum densities and sparged with pure nitrogen gas. Together, these observations resolved apparent contradictions in the literature on metabolic engineering strategies required for anaerobic growth of S. cerevisiae on d-xylose and expanded our knowledge on the potential relevance of CO2 availability and anaplerotic carboxylation reactions on anaerobic d-xylose fermentation by metabolically engineered S. cerevisiae strains. \n\nTo ensure standardization and reproducibility of scientific results, yeast growth media in academia as well as industry are routinely supplemented with vitamins to prevent potential vitamin limitations from affecting the studied phenotype. Careful investigation of the exact vitamin requirements and prototrophies (i.e the ability to synthesize certain vitamins intracellularly), has the potential to significantly reduce media costs. Previously, whole genome sequencing of the laboratory strain S. cerevisiae CEN.PK113-7D revealed the presence of all biosynthesis genes assumed to be required to synthesize biotin (vitamin H\/B7). Nevertheless, this strain showed only barely detectable growth in biotin-free media.\n\nCHAPTER 5 of this thesis was inspired by the academic interest in unravelling the as yet unknown aspects of the biotin biosynthesis pathway in S. cerevisiae, and by the attractivity of biotin prototrophic S. cerevisiae strains for industrial and academic use. To this end, CEN.PK113-7D was selected in media lacking this expensive supplement. Using parallel sequential batch cultures and accelerostat regimes yielded biotin prototrophic strains, some of which grew as fast in the absence of biotin as in its presence. Whole-genome sequencing and reverse-engineering studies identified a massive amplification of BIO1 to be predominantly responsible for improved growth in biotin-free media. The additional deletion of the genes encoding the transporters Tpo1 and\/or Pdr12, which were found to be inactivated in evolved prototrophic strains, further improved the growth rates of a BIO1-overexpressing strain. The identification of metabolic engineering targets for obtaining biotin prototrophic yeasts in CHAPTER 5 has the potential to improve process economics of a possibly large number of biotechnological products and to inspire future researchers to expand this method to other expensive growth factors.","auteur":"Jasmine Bracher","auteur_slug":"jasmine-bracher","publicatiedatum":"17 januari 2019","taal":"EN","url_flipbook":"https:\/\/ebook.proefschriftmaken.nl\/ebook\/jasminebracher?iframe=true","url_download_pdf":"https:\/\/ebook.proefschriftmaken.nl\/download\/c5c496b6-ace6-476b-8b5d-6695799e58c1\/optimized","url_epub":"","ordernummer":"FTP-202604030725","isbn":"978-94-6380-178-2","doi_nummer":"","naam_universiteit":"Overig","afbeeldingen":14349,"naam_student:":"","binnenwerk":"","universiteit":"Overig","cover":"","afwerking":"","cover_afwerking":"","design":""},"_links":{"self":[{"href":"https:\/\/www.proefschriftmaken.nl\/en\/wp-json\/wp\/v2\/us_portfolio\/7740","targetHints":{"allow":["GET"]}}],"collection":[{"href":"https:\/\/www.proefschriftmaken.nl\/en\/wp-json\/wp\/v2\/us_portfolio"}],"about":[{"href":"https:\/\/www.proefschriftmaken.nl\/en\/wp-json\/wp\/v2\/types\/us_portfolio"}],"author":[{"embeddable":true,"href":"https:\/\/www.proefschriftmaken.nl\/en\/wp-json\/wp\/v2\/users\/8"}],"replies":[{"embeddable":true,"href":"https:\/\/www.proefschriftmaken.nl\/en\/wp-json\/wp\/v2\/comments?post=7740"}],"version-history":[{"count":1,"href":"https:\/\/www.proefschriftmaken.nl\/en\/wp-json\/wp\/v2\/us_portfolio\/7740\/revisions"}],"predecessor-version":[{"id":7743,"href":"https:\/\/www.proefschriftmaken.nl\/en\/wp-json\/wp\/v2\/us_portfolio\/7740\/revisions\/7743"}],"wp:featuredmedia":[{"embeddable":true,"href":"https:\/\/www.proefschriftmaken.nl\/en\/wp-json\/wp\/v2\/media\/14349"}],"wp:attachment":[{"href":"https:\/\/www.proefschriftmaken.nl\/en\/wp-json\/wp\/v2\/media?parent=7740"}],"wp:term":[{"taxonomy":"us_portfolio_category","embeddable":true,"href":"https:\/\/www.proefschriftmaken.nl\/en\/wp-json\/wp\/v2\/us_portfolio_category?post=7740"}],"curies":[{"name":"wp","href":"https:\/\/api.w.org\/{rel}","templated":true}]}}