{"id":7416,"date":"2026-04-02T11:15:25","date_gmt":"2026-04-02T11:15:25","guid":{"rendered":"https:\/\/www.proefschriftmaken.nl\/portfolio\/hui-ying-yeoh\/"},"modified":"2026-04-02T11:15:31","modified_gmt":"2026-04-02T11:15:31","slug":"hui-ying-yeoh","status":"publish","type":"us_portfolio","link":"https:\/\/www.proefschriftmaken.nl\/en\/portfolio\/hui-ying-yeoh\/","title":{"rendered":"Hui Ying Yeoh"},"content":{"rendered":"","protected":false},"excerpt":{"rendered":"","protected":false},"author":8,"featured_media":7417,"comment_status":"closed","ping_status":"closed","template":"","meta":{"_acf_changed":false,"footnotes":""},"us_portfolio_category":[45],"class_list":["post-7416","us_portfolio","type-us_portfolio","status-publish","has-post-thumbnail","hentry","us_portfolio_category-new-template"],"acf":{"naam_van_het_proefschift":"Folding of CFTR transmembrane domains in the endoplasmic reticulum","samenvatting":"Eiwitten zijn verantwoordelijk voor de uitvoerende functies van de cel en ze komen voor als oplosbare en membraan-gebonden versies, waarvan de laatsten in de plasmamembraan van de cel zitten en daarom aangeduid worden als transmembraan (TM)-eiwitten. Hiervan zijn er ongeveer half zo veel als van het aantal oplosbare eiwitten. Een TM-eiwit kan een of meerdere keren met een hydrofoob TM-domein (TMD) door het membraan rijgen. TM-eiwitten vervullen een grote verscheidenheid aan functies, zoals o.a. het transporteren van kleine moleculen en ionen, doorgeven van signalen van buiten de cel naar binnen en vice versa, en het hechten van cellen aan elkaar. Membraaneiwitten worden gemaakt in het endoplasmatisch reticulum (ER), een compartiment dat specifiek is uitgerust met een zogenaamde chaperonne-machinerie om eiwitten te laten vouwen tot een vorm die nodig is voor hun functie. Het deel van een TM-eiwit dat zich in het cytosol bevindt, wordt door een andere groep chaperonnes gevouwen. In tegenstelling tot de grote kennis die we hebben over de vouwing van dit deel van een TM eiwit, weten we weinig over de mechanismen hoe TM chaperonnes bijdragen aan de vouwing van een TMD, o.a. omdat het pas sinds kort mogelijk is deze vraag experimenteel te benaderen.\n\nIn Hoofdstuk 1 zetten we op een rij hoe membraangebonden chaperonnes een rol zouden kunnen spelen bij het vouwen van TM-eiwitten aan de hand van CFTR (Cystic Fibrosis Transmembrane Conductance Regulator), ons modeleiwit. CFTR is lid van de ABC-transporterfamilie en heeft twee TMDs, twee cytoplasmatische nucleotide bindende domeinen (NBDs) en een ongestructureerd R-domein. In de architectuur van CFTR zijn TMD1, NBD1, R, TMD2 en NBD2 in deze volgorde aan elkaar geschakeld, een arrangement dat karakteristiek is voor de ABC-transporterfamilie. De structuur van CFTR, met afwisselende gedeeltes in het cytosol, in de membraan en buiten de cel, komt ook voor bij andere membraaneiwitten en vormt een grote uitdaging voor de eivitvouwingsmachinerie. Hierdoor is CFTR een ideaal model voor het ophelderen van de vouwing van complexe membraaneiwitten. Verstoring van de CFTR-functie door erfelijke afwijkingen in de DNA volgorde kan Cystic Fibrosis (taaislijmziekte) veroorzaken. Bij deze ziekte vormen zich slijmophopingen in de luchtwegen, het spijsverteringskanaal en de voortplantingsorganen. In longen worden hierdoor de ingeademde bacteri\u00ebn niet voldoende effici\u00ebnt afgevoerd waardoor infecties ontstaan, die uiteindelijk de meest voorkomende doodsorzaak voor pati\u00ebnten zijn. Inzicht in CFTR-vouwing zal daarom ook medisch relevante informatie over de ziekte opleveren.\n\nIn Hoofdstuk 2 hebben we methoden beschreven voor het meten en analyseren van CFTR-vouwing met behulp van radioactieve \u2018pulse chase\u2019. Pulse-chase labeling met radioactieve aminozuren voor nieuw te vormen eiwitten is een krachtig hulpmiddel voor het bestuderen van eivitvouwing, het vervoer van eiwitten tussen organellen en de afbraak van eiwitten in cellen. In deze benadering wordt een kleine fractie van de totale hoeveelheid eiwit tijdens haar aanmaak radioactief gelabeld gedurende korte radiolabelingstijden (\u2018pulse\u2019). Vouwing kan worden gevolgd gedurende de \u2018chase\u2019 waar geen radioactieve bouwstenen meer aanwezig zijn. In combinatie met \u2018limited proteolysis\u2019, immunoprecipitatie met domeinspecifieke antilichamen en reducerende SDS-polyacrylamidegelelektroforese (SDS-PAGE), kunnen vouwingsprocessen van het te bestuderen eiwit tot in detail worden onderzocht.\n\nCFTR vouwt bij benadering in twee stappen, waarbij de domeinen eerst individueel vouwen tijdens de synthese. Wanneer deze stap is voltooid, assembleren de domeinen tot een functioneel eiwit. Het is daarom belangrijk om de vouwing van elk domein te begrijpen, aangezien dit direct verband houdt met de vorm en functtie van het gehele CFTR. Vanwege het gebrek aan geschikte reagentia is het vouwen van CFTR transmembraandomeinen (TMDs) en hun assemblage nog slechts ten dele begrepen. We hebben daarom antilichamen tegen TMD1 en TMD2 gemaakt om het vouwen van de TMDs te bestuderen in Hoofdstuk 3. Met deze antistoffen konden we laten zien dat de TMDs post-translationele vormveranderingen ondergaan die het resultaat zijn van domeinassemblage van CFTR.\n\nVervolgens werden de nieuwe antilichamen ingezet om het vouwen van een reeks CFTR pati\u00ebnten-mutanten te bestuderen (Hoofdstukken 4 en 5). In Hoofdstuk 5 hebben we aangetoond dat de milde R751L-mutant vergelijkbaar vouwt en reageert op geneesmiddelen als wild-type CFTR. In Hoofdstuk 4 hebben we CFTR klasse-IV mutanten onderzocht, waarvan we ondermeer hebben vastgesteld dat mutatie R347P verkeerd is geclassificeerd. R347P is de enige mutatie in klasse IV die leidt tot grotere defecten in domeinassemblage. Aangezien R347 zich bevindt in TMD1, kan een mutatie van arginine naar proline de interactie tussen de TMDs van CFTR verstoren en daarmee ook de domeinassemblage. R347P reageert niet op het onlangs goedgekeurde geneesmiddel VX-770, dat het CFTR kanaal opent, terwijl de meeste andere klasse-IV-mutanten er wel op reageren. Door dit criterium en door de functionele verbetering door corrector-geneesmiddel VX-809, kwalificeren we R347P dan ook als een klasse II-mutatie. Onze studie toonde aan dat de nieuwe antilichamen conformatie-defecten in CFTR kunnen detecteren en een nieuwe benadering bieden voor het karakteriseren van de werkingswijze van nieuwe therapeutische middelen. Deze antilichamen kunnen daarom worden gebruikt om te onderzoeken welke geneesmiddelen effectief zijn voor welke variant van taaislijmziekte.\n\nR347 is een van de geladen aminozuren in het eerste TMD van CFTR. Dergelijke aminozuren op zulke specifieke locaties in membraaneiwitten dienen zowel structurele als functionele doeleinden. De lading van R347 is niet gekoppeld aan die van een ander residue in TMD1. Het ER-membraancomplex (EMC) is een geconserveerd eiwitcomplex, dat TMDs met geladen aminozuursequenties kan begeleiden als chaperonne in een nog niet precies begrepen mechanisme. Van het EMC werd eerder gerapporteerd dat het bindt aan CFTR hetgeen we konden bevestigen en uitdiepen in Hoofdstuk 6. Met de pulse-chase-methode gevolgd door limited proteolysis en immunoprecipitatie met de TMD-antilichamen, ontdekten we dat het EMC tijdens de synthese helpt bij het vouwen van TMD2, in een interactie die hoogstwaarschijnlijk gedreven wordt door ladings-krachten in de TM-gebieden van de twee eiwitten. Deze chaperonne functie is specifiek voor TMD2 en werd niet gezien voor de andere domeinen. Daarnaast voorkomt het EMC vroege afbraak van CFTR in het ER. In cellen zonder EMC werd post-translationele assemblage van CFTR verlaagd als gevolg van een gedestabiliseerd TMD2. Deze experimenten bieden direct inzicht in de rol van EMC bij het vouwen van TMDs die destabiliserende eigenschappen bevatten.\n\nEen ander CFTR-chaperonne, Bap31 bevat net als EMC geladen TM-residuen en bindt aan CFTR v\u00f3\u00f3r domein-assemblage. Bap31 werkt samen met TMD1 en sorteert CFTR naar de ER-geassocieerde afbraak route, maar de functie van Bap31 als chaperonne van CFTR-geladen residuen is niet onderzocht. In Hoofdstuk 7 laten we met behulp van de TMD-antistoffen zien dat de geladen residuen in de TMDs van Bap31 nodig zijn om de TMDs van CFTR post-translationeel te stabiliseren en dat Bap31-binding een effici\u00ebnte CFTR-domeinassemblage mogelijk maakt. We vermoeden daarom dat Bap31 CFTR helpt met vouwen door te voorkomen dat geladen residuen in de TMDs interacties aangaan met andere membraaneiwitten en daarmee fungeert als facilitator en kwaliteitscontrole voor CFTR-domeinassemblage.\n\nTen slotte worden in Hoofdstuk 8 de resultaten van de experimentele hoofdstukken in een bredere context besproken, met nadruk op de mogelijke selectiecriteria en bindings-mechanismen van EMC en Bap31. Verder correleren we het vouwings mechanisme van CFTR met andere type I ABC-transporters en stellen we een model voor hoe de twee chaperonnes werken bij het vouwen van CFTR. Dit model kan ook een nuttige beschrijving bieden voor het begrijpen van de vouwingsroutes van andere membraaneiwitten die zowel EMC als Bap31 gebruiken.","summary":"Thirty percent of eukaryotic proteins are membrane proteins, which contain at least one transmembrane domain (TMD) formed by one or more transmembrane (TM) helixes. These proteins carry out a large variety of functions, including transporting small molecules and ions, transducing signals, cell adhesion, protein trafficking, and membrane formation. Membrane proteins are synthesized in the Endoplasmic Reticulum (ER), an organelle specifically endowed with machinery for executing general protein folding and post-translational modifications. The TMDs of membrane proteins may encounter several folding challenges during biogenesis, many of which can be resolved by binding to chaperones. In Chapter 1, we discuss these problems and the putative membrane-bound chaperones that may be involved in solving them. Although the role of cytoplasmic chaperones in protein folding has been extensively studied, interactions between membrane proteins and membrane-bound chaperones are only recently being explored.\n\nIn Chapter 1 we also describe the Cystic Fibrosis Transmembrane Conductance Regulator (CFTR), our model protein for studying membrane protein folding and chaperones in the ER. CFTR is a member of the ABC transporter family. It has two TMDs and two cytoplasmic nucleotide binding domains (NBDs) and an unstructured R-region. The domain hierarchy of CFTR comprises TMD1 followed by NBD1, (R), TMD2, and NBD2, and is highly conserved among ABC transporters. CFTR poses many typical folding problems that are common in membrane proteins, which makes it an ideal example for uncovering the folding pathway of these proteins. Disrupting CFTR conformation can cause Cystic Fibrosis, a disease that causes mucus accumulation and promotes infections in the respiratory, digestive, and reproductive systems. Understanding CFTR folding will therefore also provide medically relevant information about this disease.\n\nIn this thesis, we analyzed CFTR biogenesis and maturation using a radioactive pulse-chase assay. This is a powerful tool for studying the conformational maturation, trafficking between organelles, and degradation of target proteins in live cells (Chapter 2). In this approach, a small fraction of the total protein pool is \u2018tagged\u2019 during short radiolabeling times (<30 min; i.e pulse) and maturation and protein trafficking is then followed during tightly controlled chase times. When combined with limited proteolysis, immunoprecipitation with domain-specific antibodies, and nonreducing\/reducing SDS-polyacrylamide gel electrophoresis (SDS PAGE), folding processes of a target protein can be examined in great detail.\n\nCFTR folds in two steps: the domains of CFTR fold during biosynthesis and when biosynthesis is completed they assemble to form a functional protein. It is therefore important to understand the folding of each domain as this is profoundly connected to the overall conformation of CFTR. Due to a paucity of suitable reagents, the folding of CFTR transmembrane domains (TMDs) and their assembly is poorly understood. We thus generated three antibodies against TMD1 and TMD2 to study the folding of these TMDs in Chapter 3. These antibodies revealed that the TMDs undergo post-translational conformational changes that are the result of CFTR domain assembly.\n\nThe antibodies generated in Chapter 3 were then used to detect the folding of a series of CFTR patient mutants. While investigating the folding of CFTR class III and IV mutants, whose grouping is based on the ability to reach the cell surface albeit in a form with limited function, we discovered that mutation R347P is mis-classified (Chapter 4). R347P is the only mutation in the class III and IV mutations that leads to major defects in domain assembly. As R347 is located in TMD1, a mutation into proline may disrupt the interaction between the TMDs of CFTR and interfere with domain assembly. R347P does not respond to the recently approved potentiator VX-770, which opens the channel, whereas most other class-III and class-IV mutants do respond to it. By this criterion and by its functional response to corrector drug VX-809, R347P qualifies also as a class-II mutation. Our study demonstrated that the new antibodies can detect CFTR conformation defects and provide an unbiased approach for characterizing the mode of action of novel therapeutic compounds. These antibodies can therefore be used for investigating which drugs are effective for which cystic fibrosis disease variant.\n\nR347 is one of the charged residues located in the TM area of CFTR. Such amino acids at these specific locations in a membrane protein serve both structural and functional purposes. Nevertheless, the uncoupled TM charged residues can disturb the thermodynamics of the ER membrane, and how to stabilize them is one of the main problems of membrane protein folding.\n\nWe also used the antibodies described in Chapter 3 to characterize the effect of the R751L mutation on CFTR folding (Chapter 5). In comparison to R347P, R751L exerted less effect on CFTR domain folding and assembly but impaired CFTR function. This likely is because R751 is located in the R-region, a part of the protein that does not play a main role in CFTR domain assembly but is responsible for channel opening and closing. In Chapter 5, we showed that R751L folds and responds to VX-770 and VX-809 like wild-type protein instead of another CFTR mutant, delF508, whose domain folding and assembly are heavily disrupted. Like Chapter 4, Chapter 5 also demonstrated a correlation between CFTR folding and its function in vivo in man.\n\nThe ER membrane complex (EMC) is a highly conserved ER-resident complex that can chaperone TMDs with charged amino acid sequences, though the precise mechanism how it does this remains largely unknown. The EMC was reported to interact with CFTR, and this finding was confirmed and extended in Chapter 6. By using a radiolabeling coupled protease susceptibility assay, and immunoprecipitation with the TMD antibodies, we discovered that EMC assists the folding of TMD2, but not of the other domains, and that EMC prevents early degradation of CFTR in the ER. CFTR post-translational assembly was also decreased due to a destabilized TMD2 in cells without EMC. These experiments provide direct evidence of how EMC assists the folding of polytopic TMDs that contain destabilizing features.\n\nIn Chapter 6 we also showed that CFTR TMD2 engaged the chaperone EMC during translation. This binding is most likely driven by ionic forces at the TM areas of the two proteins, as they both contain charged residues. Another CFTR chaperone, Bap31, also contains charged TM residues and binds to pre-domain assembly CFTR. Bap31 interacts with TMD1 and sorts CFTR to ER-associated degradation (ERAD), but its function in chaperoning CFTR charged residues has not been studied. In Chapter 7, using the TMD antibodies, our results revealed that the charged residues in the Bap31 TMs are required to stabilize TMDs of CFTR post-translationally and Bap31 binding maintains efficient CFTR domain assembly. We therefore propose that Bap31 chaperones CFTR folding by preventing CFTR TM charged residues from interacting with the lipid bilayer and thus acts as quality control for CFTR domain assembly.\n\nFinally, in the discussion (Chapter 8), we reviewed the results in a broader context, considering what the possible selection criteria and binding mechanisms of EMC and Bap31 could be. In this chapter we also relate the folding mechanism of CFTR to other type-I ABC transporters and membrane proteins. Finally, we propose a model of how these two chaperones act in the folding of CFTR. This model may also provide a useful description for understanding the folding pathways of other membrane proteins that require both the EMC and Bap31.","auteur":"Hui Ying Yeoh","auteur_slug":"hui-ying-yeoh","publicatiedatum":"8 april 2020","taal":"EN","url_flipbook":"https:\/\/ebook.proefschriftmaken.nl\/ebook\/huiyingyeoh?iframe=true","url_download_pdf":"https:\/\/ebook.proefschriftmaken.nl\/download\/a4bbedc1-cf82-4e45-938d-ea82e7e6ddf0\/optimized","url_epub":"","ordernummer":"FTP-202604021107","isbn":"978-90-393-7277-7","doi_nummer":"","naam_universiteit":"Universiteit Utrecht","afbeeldingen":7418,"naam_student:":"","binnenwerk":"","universiteit":"Universiteit Utrecht","cover":"","afwerking":"","cover_afwerking":"","design":""},"_links":{"self":[{"href":"https:\/\/www.proefschriftmaken.nl\/en\/wp-json\/wp\/v2\/us_portfolio\/7416","targetHints":{"allow":["GET"]}}],"collection":[{"href":"https:\/\/www.proefschriftmaken.nl\/en\/wp-json\/wp\/v2\/us_portfolio"}],"about":[{"href":"https:\/\/www.proefschriftmaken.nl\/en\/wp-json\/wp\/v2\/types\/us_portfolio"}],"author":[{"embeddable":true,"href":"https:\/\/www.proefschriftmaken.nl\/en\/wp-json\/wp\/v2\/users\/8"}],"replies":[{"embeddable":true,"href":"https:\/\/www.proefschriftmaken.nl\/en\/wp-json\/wp\/v2\/comments?post=7416"}],"version-history":[{"count":1,"href":"https:\/\/www.proefschriftmaken.nl\/en\/wp-json\/wp\/v2\/us_portfolio\/7416\/revisions"}],"predecessor-version":[{"id":7419,"href":"https:\/\/www.proefschriftmaken.nl\/en\/wp-json\/wp\/v2\/us_portfolio\/7416\/revisions\/7419"}],"wp:featuredmedia":[{"embeddable":true,"href":"https:\/\/www.proefschriftmaken.nl\/en\/wp-json\/wp\/v2\/media\/7417"}],"wp:attachment":[{"href":"https:\/\/www.proefschriftmaken.nl\/en\/wp-json\/wp\/v2\/media?parent=7416"}],"wp:term":[{"taxonomy":"us_portfolio_category","embeddable":true,"href":"https:\/\/www.proefschriftmaken.nl\/en\/wp-json\/wp\/v2\/us_portfolio_category?post=7416"}],"curies":[{"name":"wp","href":"https:\/\/api.w.org\/{rel}","templated":true}]}}