{"id":6540,"date":"2026-04-01T09:46:36","date_gmt":"2026-04-01T09:46:36","guid":{"rendered":"https:\/\/www.proefschriftmaken.nl\/portfolio\/eligio-iannetti\/"},"modified":"2026-04-01T09:46:50","modified_gmt":"2026-04-01T09:46:50","slug":"eligio-iannetti","status":"publish","type":"us_portfolio","link":"https:\/\/www.proefschriftmaken.nl\/en\/portfolio\/eligio-iannetti\/","title":{"rendered":"Eligio Iannetti"},"content":{"rendered":"","protected":false},"excerpt":{"rendered":"","protected":false},"author":8,"featured_media":6541,"comment_status":"closed","ping_status":"closed","template":"","meta":{"_acf_changed":false,"footnotes":""},"us_portfolio_category":[45],"class_list":["post-6540","us_portfolio","type-us_portfolio","status-publish","has-post-thumbnail","hentry","us_portfolio_category-new-template"],"acf":{"naam_van_het_proefschift":"Cell-phenotypic profiling of mitochondrial dysfunction for target discovery and drug testing","samenvatting":"Het belangrijkste doel van dit promotieonderzoek was het karakteriseren van de consequenties voor de cel van het disfunctioneren van mitochondri\u00ebn. Dit is gedaan op fenotypische niveau voor Target Discovery en het testen van geneesmiddelen. Om dit te doen heb ik mij gericht op het ontwikkelen van nieuwe geautomatiseerde live-cell imaging technieken en de optimalisatie van cel-gebaseerde assays. Deze technieken zijn toegepast op de Primary Human Skin Fibroblasts (PHSF) afgenomen van zowel gezonde donoren als van pati\u00ebnten met het Syndroom van Leigh (SvL). SvL is een ernstige neurologische afwijking die zich meestal openbaart in het eerste levensjaar door het versneld verliezen van mentale en motorieke capaciteiten. De pati\u00ebnt overlijdt typisch binnen twee tot drie jaar, meestal door het falen van het ademhalingssysteem (Gerards et al., 2016). De bij de SvL pati\u00ebnten afgenomen PHSF\u2019s, die in deze studie gebruikt zijn, vertonen de meest voorkomende mitochondriale oxidatieve phosphorylyse (OXPHOS) enzym afwijking, namelijk het tekort aan het ge\u00efsoleerde complex I (Fassone and Rahman, 2012; Ma et al., 2013).\n\nHoofdstuk 1 introduceert de structuur, de functie en het disfunctioneren van mitochondri\u00ebn van moleculair tot klinische niveau, inclusief de strategie om drugs te ontwikkelen. Het belang van mitochondri\u00ebn op de gezondheid van de mens wordt benadrukt. Het concept van de mitochondriale morphofunctie wordt ook behandeld. Dit concept benadrukt de belangrijke interactie tussen vorm en functioneren. De morphofunctie is een essenti\u00eble indicator van de mitochondriale en algemene gezondheidstoestand van de cel, en wordt in elk hoofdstuk van dit proefschrift gemeten of bediscussieerd. Het hoofdstuk gaat verder met de beschrijving van de ernstige klinische aspecten van mitochondriale ziektes, specifiek het tekort aan CI en SvL zijn ziektebeelden waarvoor geen goede behandeling bestaat. De introductie wordt afgesloten met een overzicht van het proces van het ontwikkelen van geneesmiddelen met een focus op in vitro pre-klinisch werk. Cell-based fenotypisch screening wordt gepresenteerd als de belangrijkste methodologische aanpak die door farmaceutische bedrijven wordt gebruikt voor Target Discovery en het testen van drugs.\n\nEr bestaat een groot aantal technologie\u00ebn voor het evalueren van de bijdrage van mitochondri\u00ebn aan ziektes en voor het uitvoeren van preklinisch in vitro geneesmiddelen ontwikkeling. Sommige van deze technieken zijn commercieel beschikbaar, andere alleen nog in het laboratorium. In Hoofdstuk 2 presenteer ik een kritisch overzicht van de literatuur over het gebruik van live-cell, hoge resolutie microscopie dat gebruikt wordt voor het karakteriseren van het disfunctioneren van mitochondri\u00ebn door middel van fenotypische profilering gebaseerd op beelden. Gedetailleerde richtlijnen voor live-cell imaging technieken worden hier gepresenteerd om de ontwikkelde technieken in de experimentele hoofdstukken van dit proefschrift te introduceren. Vanuit dit perspectief bediscussieer ik een selectie van live-cell fluorescentie reporters, de gebruikte imaging strategie en modellen van de menselijk cel met hun voor- en nadelen. We presenteren ook een overzicht van live-cell toepassing van microscopie die gebruikt worden voor het detecteren van cellulaire fenotypes gekoppeld aan ziektes en voor het uitvoeren van cel gebaseerde screening van geneesmiddelen.\n\nHoofdstuk 3 richt zich op hoe mitochondriaal morphofunction kan worden bestudeerd en gecombineerd met high-content en high-troughput strategie\u00ebn. Het hoofdstuk behandelt verschillende toepassingen hiervan, die worden gebruikt om genetische en door geneesmiddelen veroorzaakte effecten op het niveau van individuele organellen, cellen en cel populaties te analyseren. In Hoofdstuk 4 presenteren wij een nieuw protocol dat ontwikkeld is om gemultiplexde high-content analyses van mitochondriale morphofunctie uit te voeren. Dit maakt het mogelijk om de mitochondriale morphofunctie en de cellulaire en nucleaire parameters in de PHSF\u2019s onbevooroordeeld en geautomatiseerd te kwantificeren. Cellen werden gekweekt op 96-well kweekplaten en verkleurd met drie fluorescentie kleurstoffen die gericht zijn op mitochondri\u00ebn, cytosol en kernen. Beelden van multi-spectrale fluorescentie zijn verkregen met geautomatiseerde microscopie waaruit de waarde van 44 descriptoren ge\u00ebxtraheerd zijn. Deze data werd vervolgens onderworpen aan univariate, bivariate en multivariate analyse. Hoewel dit protocol specifiek voor PHSF\u2019s ontwikkeld is kan het ook worden toegepast op andere cel types. In Hoofdstuk 5 wordt dit protocol toepast op het HT22 neuronaal cel model. Mitochondriale morphofunctionele analyse werd gebruikt om de flexibiliteit van het cellulaire metabolisme te analyseren met lage-geleiding Ca2+-geactiveerde K kanalen om vervolgens de fenotypische consequenties te onderzoeken. HT22 werd behandeld met de chemische verbinding CyPPA om farmacologische SK-activering te induceren. Bij aanwezigheid van glucose in het cultuur medium produceren veel in vitro gekweekte cel modellen bijna alle ATP via glycolyse in plaats van met het mitochondriale OXPHOS systeem (Crabtree, 1929). Daarom is het een algemeen gebruikte experimentele opzet om glucose te vervangen door galactose in het cultuur medium om pathologische mitochondriale fenotypes te induceren of te versterken (Robinson et al., 1992; Rossignol et al., 2004). Deze strategie forceert dat de ATP productie afhangt van het mitochondriale metabolisme, dat glycolyse opregulering wordt voorkomen en dat metabolische flexibiliteit wordt beperkt (Rossignol et al., 2004). Om de cellulaire compensatie mechanismes van de inhibitie van glycolytische opregulering te beperken, hebben wij in Hoofdstuk 5 de mitochondriale morphofunctionele analyse van de met CyPPA behandelde HT22 cellen uitgevoerd in galactose- en glucose gebaseerde media.\n\nIn Hoofdstuk 6 gebruiken wij ook de op galactose gebaseerde medium strategie waarmee een metabolische stress wordt opgewerkt die de afwijkingen van het PSHF CI tekort verstrekt. Wij hebben een cellulaire en mitochondriale fenotype karakterisering uitgevoerd van de cellen met een mitochondriale ziekte die in een galactose gebaseerd medium groeien en die vergeleken met cellen die in een glucose gebaseerd medium groeien. We onderzochten de levensvatbaarheid van de cel, de mitochondriale morfofunctie, de reactieve zuurstof species en de ATP-homeostase. Een paneel van 6 cellijnen werd gebruikt, drie afgeleid van gezonde donoren en drie van pati\u00ebnten met LS die mutaties vertonen in de CI genen (NDUFS7, NDUFS8, NDUFVN) gecodeerd in het nucleaire DNA (n-DNA). Na een optimalisaties van het celcultuur protocol en van de samenstelling van het op glucose gebaseerde medium, stierven de LS fibroblasten in het galactose medium terwijl de control cellen bleven leven. De sterfte onder LS-cellen werd afhankelijk van de dosering geremd door pyruvaat, malaat, oxaloacetaat, \u03b1-ketoglutaraat, aspartaat en exogeen NAD+ (eNAD), maar niet door lactaat, succinaat, \u03b1-ketobutyraat en uridine. Pyruvaat en eNAD verhoogde het gehalte van cellulair NAD+ in de met galactose behandelde LS-cellen in verschillende mate. Co-incubatie studies lieten zien dat de door pyruvaat geinduceerde redding niet primair door NAD wordt gemedieerd. De vervanging van glucose door galactose in de LS-cellen verhoogde de mitochondriale fragmentatie en massa, depolariseerde de mitochondriale membraan potentiaal (\u2206\u03c8, verhoogde het H2DCFDA-oxiderende ROS-niveau, verhoogde de vorming van de mitochondriale ATP en verminderde het totale cellulaire ATP-gehalte. Deze afwijkingen werden op een verschillende manier gered door pyruvate en eNAD wat de conclusie ondersteunt dat deze verbindingen via verschillende mechanismes de sterfte van LS-cellen veroorzaakt door galactose beperken. Deze bevindingen leggen een nieuwe cel-gebaseerde strategie vast voor het testen van interventies en versterken ons begrip van de pathofysiologie van het tekort aan CI.\n\nHoofdstuk 7 presenteert net als hoofdstuk 6 een fenotypische en moleculaire karakterisering van door CI-tekort ge\u00efnduceerde afwijkingen in PSHF\u2019s, onder een conditie van stress. In deze studie wordt een redox stress opgelegd door de cellen te behandelen met L-buthionine-(SIR)-sulfoximine (BSO) wat de concentratie van de belangrijkste cellulaire oxidant, glutathion (GSH), vermindert. Net als in hoofdstuk 6 werden zes cellijnen gebruikt, drie van gezonde donoren en drie van pati\u00ebnten met LS met mutaties in de CI genen ((NDUFS7, NDUFS2, NDUFVN). De NDUFS7 cellijn was dezelfde als in hoofdstuk 6, echter de ander twee wijken af: de NDUFS2 was een andere cellijn met een mutatie in een ander gen van het CI, NDUFVN heeft een andere mutatie op hetzelfde gen van het CI. We hebben eerder laten zien dat de GSH synthese-inhibitor BSO het cellulaire GSH gehalte in dezelfde mate verminderd in PSHF\u2019s van LS pati\u00ebnten als in gezonde controle donoren. Het was interessant dat de BSO behandeling de levensvatbaarheid van cellen van LS pati\u00ebnten sterk reduceert (allemaal met een ge\u00efsoleerde mitochondriale CI tekort), terwijl CT cellen levensvatbaar bleven. De oorzaak voor dit verschil in invloed is nog niet bekend. In dit laatste hoofdstuk voerden wij ook een fenotypische en moleculaire profilering uit van LS- en CT cellen om het effect van BSO te bestuderen voordat de celsterfte werd ge\u00efnduceerd. De incubatie gedurende 24 uur van PSHF\u2019s met een niet-giftige BSO-concentratie (1 \u00b5M) verminderde de mitochondriale en cytosolische GSH-niveaus in LS en CT cellen op dezelfde wijze. Geen afwijkingen in de mitochondriale morfofunctie, het cellulaire ATP gehalte of de cellulaire lipide peroxidatie toestand werd geobserveerd tot 2 uur voordat de cel sterfte werd geinduceerd. Als de lipide peroxidatie toestand echter op een latere tijdstip (12 of 18 uur) werd gemeten werd een uitbarsting waargenomen tegelijkertijd met een vermindering van de levensvatbaarheid van de cel die geidentificeerd kan worden als een LS-specifiek pathologisch fenotype. We hebben eerder gedemonstreerd dat KH176m, het metaboliet van een nieuwe geneesmiddel KHN7S dat in de klinisch fase is, de BSO-geinduceerde celsterfte volledig stopt. Hier geven wij voorlopige bewijs dat deze celsterfte wordt vergezeld door een verhoogde lipide peroxidatie, wat KH176m kan voorkomen. De effectiviteit van KH176m werd ook vergeleken met Ferrosttin-1, de eerste geindentificeerde inhibitor van ferroptose, een celsterfte die ook afhankelijk is van lipide peroxidatie. Deze verkennende studie benadrukt de causale rol van lipide peroxidatie op de door BSO veroorzaakte sterfte van cellen van LS patienten en verstrekt ons begrip van het werkingsmechanisme van KH176m.","summary":"The primary aim of this PhD project was to characterize cellular consequences of mitochondrial dysfunction at the phenotypical level for target discovery and drug testing. In order to do that, I focused on the development of novel automated live-cell imaging technologies and cell-based assays optimization. These were applied mainly to Primary Human Skin Fibroblasts (PHSFs) derived from healthy donors and Leigh Syndrome (LS) patients. LS is a severe neurological disorder usually becoming apparent in the first year of life by progressive loss of mental and movement abilities. This typically results in death within two to three years, usually due to respiratory failure (Gerards et al., 2016). The PHSFs derived from LS patients used in these studies have the most common mitochondrial oxidative phosphorylation (OXPHOS) enzyme defect associated with this disease phenotype, being isolated complex I (CI) deficiency (Fassone and Rahman, 2012; Ma et al., 2013).\n\nChapter 1 introduced mitochondrial structure, function and dysfunction from the molecular level and up to the clinics including drug development strategies. The importance mitochondria execute in relation to the overall human health status is highlighted. The concept of mitochondrial morphofunction is also introduced discussing the important interaction between structure and function. As morphofunction is a key indicator of the mitochondrial and overall cellular health status, and because of its biological relevance, it was measured or discussed in every chapter of this thesis. The chapter continues introducing the devastating clinical aspects of mitochondrial diseases and in particular CI deficiency and LS that are pathologies with a high unmet medical need. The general introduction ends with an overview on the drugs development process focusing on in vitro preclinical work. In particular cell-based phenotypic screening are presented as the main methodological approach used by pharmaceutical companies for target discovery and drug testing.\n\nTo evaluate how mitochondria contributed to disease and to perform preclinical in vitro drug development, a broad collection of technologies exists, both commercially available and in research laboratories. In Chapter 2 we presented a critical review of the literature on how live-cell high content microscopy can be used for image-based phenotypic profiling to assess mitochondrial (dys)function. Comprehensive guidelines about live cell imaging technologies were here presented to introduce the applications developed in the experimental chapters of this thesis. With that perspective, we discussed a selection of live-cell fluorescent reporters and imaging strategies and human cell models and discuss their pros\/cons in mitochondrial research. We also presented an overview of live-cell high content microscopy applications used to detect disease-associated cellular phenotypes and perform cell-based drug screening.\n\nChapter 3 focused more specifically on how mitochondrial morphofunction can be studied combining high-content and high-throughput strategies. In this chapter, different applications which can be used to analyze genetic and\/or drug-induced effects at the level of individual organelles, cells and cell populations are briefly discussed. In Chapter 4 we presented a newly developed protocol to perform multiplexed high-content analysis of mitochondrial morphofunction. This allow unbiased and automated quantification of mitochondrial morphofunction, cellular and nuclear parameters in PHSFs. Cells were cultured in 96-well plates and stained with three fluorescent dyes targeting mitochondria, cytosol and nuclei. Multispectral fluorescence images were acquired using automated microscopy and processed to extract 44 descriptors. Subsequently, the descriptor data were subjected to univariate, bivariate and multivariate analysis. Although this protocol was specifically developed for PHSFs, this is transferable to other cell types. In Chapter 5 this protocol was applied to the HT22 neuronal cell model. In this study, the mitochondrial morphofunctional analysis was used to analyze cellular metabolic flexibility using small-conductance Ca2+-activated K+ channels (SK) activation and investigating its phenotypical consequences. HT22 were treated with the chemical compound CyPPA to induce a pharmacological SK activation. In the presence of glucose in the culture medium, many cell models cultured in vitro generate almost all ATP via glycolysis rather than using the mitochondrial OXPHOS system (Crabtree, 1929). Therefore, cell culture medium where glucose is replaced by galactose is a common experimental setting initially developed to induce or enhance pathological mitochondrial phenotypes (Robinson et al., 1992; Rossignol et al., 2004). This strategy enforce ATP production to rely on mitochondrial metabolism, prevent glycolysis upregulation and limit metabolic flexibility (Rossignol et al., 2004). In Chapter 5, in order to limit cellular compensatory mechanisms by the inhibition of glycolytic upregulation, we performed mitochondrial morphofunctional analysis of CyPPA-treated HT22 cells in galactose-based media and compared it with glucose-based media as control condition.\n\nIn Chapter 6, in order to induce a metabolic stress, enhancing the PSHF CI deficiency-induced aberrations, we also used the galactose-based medium strategy. We performed a cellular and mitochondrial phenotypical characterization of the mitochondrial diseased cells growing in galactose-based medium and we compared those to the same cells growing in a glucose-based medium. We investigated cell viability, mitochondrial morphofunction, reactive oxygen species (ROS) levels and ATP homeostasis. A panel of six cell lines were used, three derived from healthy donors and three derived from LS patients harboring mutations in nuclear DNA (nDNA)-encoded CI genes (NDUFS7, NDUFS8, NDUFV1). Following optimization of the cell culture protocol and of the glucose-based medium composition, LS fibroblasts died in the galactose medium, whereas control cells did not. LS cell death was dose-dependently inhibited by pyruvate, malate, oxaloacetate, \u03b1-ketoglutarate, aspartate, and exogenous NAD+ (eNAD), but not by lactate, succinate, \u03b1-ketobutyrate, and uridine. Pyruvate and eNAD increased the cellular NAD+ content in galactose treated LS cells to a different extent and co-incubation studies revealed that pyruvate-induced rescue was not primarily mediated by NAD+. Functionally, in LS cells glucose-by-galactose replacement increased mitochondrial fragmentation and mass, depolarized the mitochondrial membrane potential (\u2206\u03c8), increased H2DCFDA-oxidizing ROS levels, increased mitochondrial ATP generation, and reduced the total cellular ATP content. These aberrations were differentially rescued by pyruvate and eNAD, supporting the conclusion that these compounds rescue galactose-induced LS cell death via different mechanisms. These findings establish a cell-based strategy for intervention testing and enhance our understanding of CI deficiency pathophysiology.\n\nChapter 7, like Chapter 6, also presented a phenotypic and molecular characterization of PSHF CI deficiency-induced aberrations under a stress condition. In this study, redox stress was induced treating the cells with L-buthionine-(S,R)-sulfoximine (BSO) to reduce the concentration of glutathione (GSH), the main cellular antioxidant. A panel of six cell lines were used, three derived from healthy donors and three derived from LS patients harboring mutations in nuclear DNA (nDNA)-encoded CI genes (NDUFS7, NDUFS2, NDUFV1). In respect to Chapter 6, while NDUFS7 cell line was the same one used in both the studies, NDUFS2 was a different cell line mutated in a different gene of CI, NDUFV1 was a different cell line with a different mutation in the same gene of CI. We previously demonstrated that the GSH synthesis inhibitor BSO decreases cellular GSH content to a similar degree in PHSFs from LS patients and control healthy donors. Interestingly, BSO treatment greatly reduced the viability of LS patient cells (all harboring an isolated mitochondrial CI deficiency), whereas healthy controls cells (CT). However, the reason for this differential BSO effect is still unclear. In this last chapter we performed phenotypic and molecular profiling of LS and CT cells to investigate the effect of BSO prior to cell death induction. PHSF incubation with a non-toxic BSO concentration (1 \u00b5M) for 24h decreased mitochondrial and cytosolic GSH levels in LS and CT cells in a similar manner. No alterations in mitochondrial morphofunction, cellular ATP content or cellular lipid peroxidation state were observed up to 2 hours prior to cell death induction. However, when lipid peroxidation was measured from 12h to 18h after BSO treatment, an oxidative burst almost concomitant with the loss of cell viability was identified as LS-specific pathological phenotype. We previously demonstrated that KH176m, the metabolite of a new clinical-stage drug candidate KH176, fully inhibited BSO-induced LS cell death. Here we provide preliminary evidence that this cell death is paralleled by increased lipid peroxidation, which is prevented by KH176m. KH176m efficacy was also benchmarked against Ferrostatin-1, the first identified inhibitor of ferroptosis, a lipid peroxidation-dependent cell death. This pilot study highlights a causative role for lipid peroxidation in the BSO-induced specific death of LS patient cells and enhances our understanding of KH176m mode-of-action.","auteur":"Eligio Iannetti","auteur_slug":"eligio-iannetti","publicatiedatum":"26 juni 2020","taal":"NL","url_flipbook":"https:\/\/ebook.proefschriftmaken.nl\/ebook\/eligioiannetti?iframe=true","url_download_pdf":"https:\/\/ebook.proefschriftmaken.nl\/download\/2a006145-e684-4c99-bd83-10d053cbd774\/optimized","url_epub":"","ordernummer":"FTP-202604010941","isbn":"978-94-6380-749-4","doi_nummer":"","naam_universiteit":"Radboud Universiteit","afbeeldingen":6542,"naam_student:":"","binnenwerk":"","universiteit":"Radboud Universiteit","cover":"","afwerking":"","cover_afwerking":"","design":""},"_links":{"self":[{"href":"https:\/\/www.proefschriftmaken.nl\/en\/wp-json\/wp\/v2\/us_portfolio\/6540","targetHints":{"allow":["GET"]}}],"collection":[{"href":"https:\/\/www.proefschriftmaken.nl\/en\/wp-json\/wp\/v2\/us_portfolio"}],"about":[{"href":"https:\/\/www.proefschriftmaken.nl\/en\/wp-json\/wp\/v2\/types\/us_portfolio"}],"author":[{"embeddable":true,"href":"https:\/\/www.proefschriftmaken.nl\/en\/wp-json\/wp\/v2\/users\/8"}],"replies":[{"embeddable":true,"href":"https:\/\/www.proefschriftmaken.nl\/en\/wp-json\/wp\/v2\/comments?post=6540"}],"version-history":[{"count":1,"href":"https:\/\/www.proefschriftmaken.nl\/en\/wp-json\/wp\/v2\/us_portfolio\/6540\/revisions"}],"predecessor-version":[{"id":6543,"href":"https:\/\/www.proefschriftmaken.nl\/en\/wp-json\/wp\/v2\/us_portfolio\/6540\/revisions\/6543"}],"wp:featuredmedia":[{"embeddable":true,"href":"https:\/\/www.proefschriftmaken.nl\/en\/wp-json\/wp\/v2\/media\/6541"}],"wp:attachment":[{"href":"https:\/\/www.proefschriftmaken.nl\/en\/wp-json\/wp\/v2\/media?parent=6540"}],"wp:term":[{"taxonomy":"us_portfolio_category","embeddable":true,"href":"https:\/\/www.proefschriftmaken.nl\/en\/wp-json\/wp\/v2\/us_portfolio_category?post=6540"}],"curies":[{"name":"wp","href":"https:\/\/api.w.org\/{rel}","templated":true}]}}