{"id":5802,"date":"2026-03-31T08:54:51","date_gmt":"2026-03-31T08:54:51","guid":{"rendered":"https:\/\/www.proefschriftmaken.nl\/portfolio\/aziza-hussein\/"},"modified":"2026-03-31T08:54:58","modified_gmt":"2026-03-31T08:54:58","slug":"aziza-hussein","status":"publish","type":"us_portfolio","link":"https:\/\/www.proefschriftmaken.nl\/en\/portfolio\/aziza-hussein\/","title":{"rendered":"Aziza Hussein"},"content":{"rendered":"","protected":false},"excerpt":{"rendered":"","protected":false},"author":8,"featured_media":5803,"comment_status":"closed","ping_status":"closed","template":"","meta":{"_acf_changed":false,"footnotes":""},"us_portfolio_category":[45],"class_list":["post-5802","us_portfolio","type-us_portfolio","status-publish","has-post-thumbnail","hentry","us_portfolio_category-new-template"],"acf":{"naam_van_het_proefschift":"Studying the role of estrogen receptor alpha in the developmental toxicity of diethylstilbestrol using alternative testing strategies","samenvatting":"Diethylstilbestrol (DES) is een synthetisch hormoon dat voor het eerst werd voorgeschreven in de periode van de jaren 1940 tot 1970 aan zwangere vrouwen om miskramen en vroeggeboorten te voorkomen, en aan vrouwen in het algemeen voor de behandeling van menstruatieproblemen en kanker. Uit latere studies bleek echter dat deze geclaimde gunstige effecten niet werden waargenomen en dat er zelfs nadelige effecten werden gerapporteerd, zoals heldercellige carcinomen en reproductieve en ontwikkelingstoxiciteit. Hoewel verhoogde niveaus van het endogene hormoon 17\u03b2-estradiol (E2) naar verluidt de kans op het ontwikkelen van kanker, zoals borstkanker, verhogen, werden de typische nadelige effecten die voor DES werden waargenomen niet in dezelfde mate gerapporteerd voor E2, hoewel DES structureel vergelijkbaar is met E2 en er wordt gesuggereerd dat DES werkt door de effecten van E2 na te bootsen. Het doel van dit proefschrift was om de verschillen in oestrogeniteit en ontwikkelingstoxiciteit tussen DES en E2 te onderzoeken met behulp van verschillende in vitro en in silico benaderingen, waarbij de nadruk lag op de potenti\u00eble rol van mogelijke verschillen in ER\u03b1-gemedieerde veranderingen in het onderliggende werkingsmechanisme.\n\nHoofdstuk 1 geeft achtergrondinformatie ter inleiding van het onderwerp. Daarnaast worden de nadelige effecten gerelateerd aan blootstelling aan DES en de bekende werkingsmechanismen van DES beschreven. De kennislacunes en het hoofddoel van het proefschrift worden gedefinieerd en de te gebruiken teststrategie\u00ebn worden uitgelegd en er wordt een algemeen overzicht van het proefschrift gegeven.\n\nHoofdstuk 2 onderzocht de mogelijke verschillen tussen DES en E2 bij de inductie van ER\u03b1-gemedieerde cellulaire effecten, waaronder ER\u03b1-gemedieerde reportergenexpressie in de U2OS CALUX-assay, ER\u03b1-gemedieerde celproliferatie, en ER\u03b1-gemedieerde-coregulatorinteracties en genexpressie in cellen van de T47D-borstkankercellijn. De verkregen resultaten geven aan dat DES en E2 ER\u03b1-gemedieerde reportergentranscriptie en T47D-celproliferatie op een vergelijkbare manier activeren. Er werden echter kleine maar significante verschillen waargenomen tussen DES- en E2-ge\u00efnduceerde binding van de ER\u03b1 aan coregulatormotieven en in transcriptomische handtekeningen. Deze verschillen, waaronder met name de door E2 ge\u00efnduceerde binding van de ER\u03b1 met verschillende co-repressormotieven, en de door DES ge\u00efnduceerde downregulatie van genen die betrokken zijn bij histondeacetylering en DNA-methylering, en upregulatie van CYP26A1 en CYP26B1, kunnen een rol spelen bij de differenti\u00eble in vivo effecten die voor DES en E2 worden gerapporteerd. Aldus konden coregulatorbinding en transcriptomische handtekeningen DES van E2 onderscheiden.\n\nIn Hoofdstuk 3 werd een alternatieve teststrategie ge\u00ebvalueerd om de in vivo ontwikkelingstoxiciteit van DES kwantitatief te voorspellen. Hiertoe werd een fysiologisch gebaseerd kinetisch (PBK) model gedefinieerd dat vervolgens werd gebruikt om concentratie-responsuitkomsten voor de in vitro ontwikkelingstoxiciteit van DES, verkregen in de ES-D3-celdifferentiatie-assay, te vertalen naar voorspelde in vivo dosis-responsgegevens voor ontwikkelingstoxiciteit. Eerdere studies toonden aan dat de door het PBK-model gefaciliteerde reverse dosimetry-benadering een nuttige aanpak is om de ontwikkelingstoxiciteit van verschillende ontwikkelingstoxines kwantitatief te voorspellen. De in dit hoofdstuk verkregen resultaten laten zien dat het PBK-model de DES-bloedconcentraties bij ratten adequaat voorspelde. Bovendien onthulde de studie dat DES positief testte in de ES-D3-differentiatie-assay en dat de door DES ge\u00efnduceerde remming van de ES-D3-celdifferentiatie kon worden tegengegaan door de oestrogeenreceptor alfa (ER\u03b1) antagonist fulvestrant, wat aangeeft dat de in vitro ES-D3-celdifferentiatie-assay in staat was de rol van ER\u03b1 te simuleren die gerapporteerd is in het werkingsmechanisme dat ten grondslag ligt aan de ontwikkelingstoxiciteit van DES in vivo. Ten slotte werden de in vitro gegevens gecombineerd met het PBK-model om een dosis-responscurve te voorspellen voor de in vivo ontwikkelingstoxiciteit van DES, en de resultaten lieten duidelijk zien dat deze combinatie de in vivo ontwikkelingstoxiciteit van DES niet op een kwantitatieve manier adequaat voorspelde. Er werd dan ook geconcludeerd dat, hoewel de EST DES kwalificeert als een ontwikkelingstoxine en de rol van ER\u03b1 in dit proces detecteert, de ES-D3-celdifferentiatie-assay van de EST blijkbaar niet het volledige werkingsmechanisme achter de door DES ge\u00efnduceerde ontwikkelingstoxiciteit in vivo vastlegt. Dit kan deels te wijten zijn aan het feit dat de ES-D3-celdifferentiatie-assay het complexe biologische systeem en de metabole capaciteit van een intact organisme mist en\/of dat de assay mogelijk niet alle werkingsmechanismen weerspiegelt die mogelijk ten grondslag liggen aan ontwikkelingstoxiciteit, waaronder bijvoorbeeld epigenetische effecten, waarvan is gerapporteerd dat ze een belangrijke rol spelen bij de ontwikkelingseffecten van DES.\n\nVanwege deze potenti\u00eble beperkingen van de EST werd in Hoofdstuk 4 de ontwikkelingstoxiciteit van DES vergeleken met E2 in de zebravis embryotoxiciteitstest (ZET). Daarnaast werd onderzocht of de rol van de ER\u03b1 in de door DES gemedieerde ontwikkelingstoxiciteit ook in de ZET kon worden aangetoond. Daartoe werd de in vitro embryotoxiciteit van DES en E2 gekwantificeerd in de ZET in af- en aanwezigheid van de ER\u03b1-antagonist fulvestrant. Resultaten verkregen in de ZET lieten zien dat DES groeivertraging, cumulatieve mortaliteit en misvormingen bij zebravissen induceerde, terwijl E2 alleen groeivertraging en cumulatieve mortaliteit vertoonde met een lagere potentie in vergelijking met DES. Bovendien induceerde DES de vorming van pericardiaal oedeem in zebravissen, wat niet werd waargenomen bij aan E2 blootgestelde zebravissen. Dit effect kon worden tegengegaan door co-blootstelling aan fulvestrant, wat aangeeft dat de ZET in staat was de rol van ER\u03b1 vast te leggen in het werkingsmechanisme dat ten grondslag ligt aan dit ontwikkelingstoxiciteitseffect van DES in zebravissen. Over het geheel genomen wordt geconcludeerd dat de ZET onderscheid maakt tussen E2 en DES met betrekking tot hun ontwikkelingstoxiciteit, terwijl de rol van ER\u03b1 in de specifieke ontwikkelingstoxiciteitseffecten gevonden voor DES wordt bevestigd. Bovendien bleek de ZET, net als de EST, niet in staat de relatief hoge in vivo potentie van DES als ontwikkelingstoxine te vangen.\n\nTen slotte werd in Hoofdstuk 5 van het proefschrift onderzocht in welke mate verschillen in kinetiek en interne dosisniveaus kunnen bijdragen aan de potenti\u00eble in vivo verschillen in effecten van E2 vs DES op de ontwikkeling. Er werd verondersteld dat een deel van de in vivo verschillen zou kunnen voortkomen uit verschillen in de interne dosisniveaus van deze twee oestrogenen tijdens de zwangerschap en\/of de DES-behandeling. Om kwantificering van dosisafhankelijke interne dosisniveaus mogelijk te maken, werden fysiologisch gebaseerde kinetische (PBK) modellen voor E2 en DES bij zwangere vrouwen gedefinieerd. De modellen voorspelden dat de kinetiek van DES en E2 bij zwangere vrouwen vergelijkbaar was. Therapeutische doses DES zoals gegeven aan zwangere vrouwen zouden leiden tot bloedspiegels die 3 tot 4 ordes van grootte hoger zijn dan endogene E2-bloedspiegels. Geconcludeerd wordt dat de ontwikkelde PBK-modellen de kwantificering van dosisafhankelijke plasmaconcentraties van DES en E2 bij zwangere vrouwen mogelijk maken en onthullen dat verschillen in effecten van DES en E2 op de ontwikkeling ten minste gedeeltelijk te wijten kunnen zijn aan verschillen in interne blootstellingsniveaus.\n\nIn Hoofdstuk 6 wordt een overzicht en discussie van de verkregen resultaten gegeven. Het hoofdstuk presenteert ook de overblijvende lacunes in de gegevens en toekomstperspectieven. Alles bij elkaar wordt geconcludeerd dat de twee oestrogenen E2 en DES verschillen in hun biologische effecten gerelateerd aan de ontwikkeling op een subtiele maar significante manier. Op cellulair niveau vertonen DES en E2 grote overeenkomsten in de moleculaire paden die gerelateerd zijn aan ER\u03b1-gemedieerde effecten met kleine significante verschillen die kunnen bijdragen aan de ontwikkelingstoxiciteit, deels via potenti\u00eble epigenetische effecten van DES. De in vitro ontwikkelingstoxiciteitsassays EST en ZET kunnen DES onderscheiden van E2 wat betreft ontwikkelingstoxiciteit, maar vangen tegelijkertijd niet het volledige werkingsmechanisme achter de door DES ge\u00efnduceerde ontwikkelingstoxiciteit. Ten slotte werd aangetoond dat naast de subtiele verschillen in toxicodynamiek, substanti\u00eble verschillen in interne concentraties (endogene E2-concentraties vergeleken met voorspelde DES-concentraties bij vrouwen die DES als medicatie gebruikten) bijdragen aan de differenti\u00eble in vivo effecten van E2 en DES.","summary":"Diethylstilbestrol (DES) is a synthetic hormone that was first prescribed in the period of 1938 to 1971 for pregnant women to prevent miscarriage and premature delivery, and to women in general for treatment of menstrual problems and cancer. However, from later studies it was concluded that these claimed beneficial effects were not observed, and even adverse effects were reported, such as clear cell carcinoma, and reproductive and developmental toxicity. Although increased levels of the endogenous hormone 17\u03b2-estradiol (E2) have been reported to increase the chances on developing cancer, such as breast cancer, the typical adverse effects observed for DES were not reported to the same extent for E2, although DES is structurally similar to E2 and it is suggested that DES acts by mimicking the effects of E2. The aim of this thesis was to investigate the differences in estrogenicity and developmental toxicity between DES and E2 using different in vitro and in silico approaches, focussing on the potential role of possible differences in ER\u03b1-mediated changes in the underlying mode of action.\n\nChapter 1 provides background information introducing the topic. In addition, the adverse effects related to DES-exposure and the known mechanisms of action of DES are described. The knowledge gaps and principal aim of the thesis are defined and the testing strategies to be used are explained and a general outline of the thesis is provided. \n\nChapter 2 investigated the possible differences between DES and E2 in induction of ER\u03b1-mediated cellular effects, including ER\u03b1-mediated reporter gene expression in the U2OS CALUX assay, ER\u03b1-mediated cell proliferation, and ER\u03b1-mediated-coregulator interactions and gene expression in cells of the T47D breast cancer cell line. The results obtained indicate that DES and E2 activate ER\u03b1-mediated reporter gene transcription and T47D cell proliferation in a similar way. However, minor but significant differences between DES- and E2-induced binding of the ER\u03b1 to coregulator motifs and in transcriptomic signatures were observed. These differences, including especially E2-induced binding of the ER\u03b1 with several co-repressor motifs, DES-induced downregulation of genes involved in histone deacetylation and DNA methylation, and upregulation of CYP26A1 and CYP26B1, may play a role in the differential in vivo effects reported for DES and E2. Thus, coregulator binding and transcriptomic signatures could discriminate DES from E2. \n\nIn Chapter 3 an alternative testing strategy to quantitatively predict the in vivo developmental toxicity of DES was evaluated. To this end a physiologically based kinetic (PBK) model was defined that was subsequently used to translate concentration-response data for the in vitro developmental toxicity of DES, obtained in the ES-D3 cell differentiation assay, into predicted in vivo dose-response data for developmental toxicity. Previous studies showed that the PBK modeling-facilitated reverse dosimetry approach is a useful approach to quantitatively predict the developmental toxicity of several developmental toxins. The results obtained in this chapter show that the PBK model adequately predicted DES blood concentrations in rats. Furthermore, the study revealed that DES tested positive in the ES-D3 differentiation assay and that DES-induced inhibition of the ES-D3 cell differentiation could be counteracted by the ER\u03b1 antagonist fulvestrant, indicating that the in vitro ES-D3 cell differentiation assay was able to capture the role of ER\u03b1 reported in the mode of action underlying the developmental toxicity of DES in vivo. Finally, the in vitro data were combined with the PBK model to predict a dose-response curve for the in vivo developmental toxicity of DES, and the results clearly showed that this combination did not adequately predict the in vivo developmental toxicity of DES in a quantitative way. Thus, it was concluded that although the EST qualifies DES as a developmental toxin and detects the role of ER\u03b1 in this process, the ES-D3 cell differentiation assay of the EST apparently does not adequately capture the full mode of action underlying DES-induced developmental toxicity in vivo. This may in part be related to the fact that the ES-D3 cell differentiation assay lacks the complex biological system and the metabolic capacity of an intact organism and\/or that the assay may not reflect all modes of action possibly underlying developmental toxicity, including for example epigenetic effects, reported to play an important role in DES-mediated developmental effects. \n\nBecause of these potential limitations of the EST, Chapter 4 assessed the developmental toxicity of DES compared to E2 in the zebrafish embryotoxicity test (ZET). In addition, it was investigated whether the role of the ER\u03b1 in DES-mediated developmental toxicity could also be demonstrated in the ZET. To this end, the in vitro embryotoxicity of DES and E2 was quantified in the ZET in the absence and presence of the ER\u03b1 antagonist fulvestrant. Results obtained in the ZET showed that DES induced growth retardation, cumulative mortality and malformations in zebrafish embryos, while E2 showed only growth retardation and cumulative mortality with a lower potency compared to DES. Additionally, DES induced pericardial edema formation in zebrafish embryos, which was not observed in E2-exposed zebrafish embryos. This effect could be counteracted by co-exposure to fulvestrant, indicating that the ZET was able to capture the role of ER\u03b1 in the mode of action underlying this developmental toxicity effect of DES in zebrafish. Overall, it is concluded that the ZET differentiates between E2 and DES with respect to their developmental toxicity, while confirming the role of ER\u03b1 in the specific developmental toxicity effects found for DES. Furthermore, like the EST, also the ZET appeared unable to capture the relatively high in vivo potency of DES as a developmental toxicant.\n\nFinally, in Chapter 5 of the thesis it was investigated to what extent differences in kinetics and internal dose levels may add to the potential in vivo differences in effects of E2 vs DES on development. It was hypothesised that part of the in vivo differences may originate from differences in the internal dose levels of these two estrogens during pregnancy and\/or DES treatment. To enable quantification of dose-dependent internal dose levels, physiologically based kinetic (PBK) models for E2 and DES in pregnant women were defined. The models predicted the kinetics of DES and E2 in pregnant women to be comparable. Therapeutic doses of DES as given to pregnant women were predicted to result in blood levels that are 3 to 4 orders of magnitude higher than endogenous E2 blood levels. It is concluded that the PBK models developed enable quantification of dose-dependent plasma concentrations of DES and E2 in pregnant women and reveal that differences in effects of DES and E2 on development may at least in part be due to differences in internal exposure levels.\n\nIn Chapter 6 an overview and discussion of the results obtained is provided. The chapter also presents remaining data gaps and future perspectives. Altogether, it is concluded that the two estrogens E2 and DES differ in their biological effects related to development in a subtle but significant way. At the cellular level, DES and E2 show high similarities in the molecular pathways that relate to ER\u03b1-mediated effects with small significant differences that may contribute to the developmental toxicity in part via potential epigenetic effects of DES. The in vitro developmental toxicity assays EST and ZET can discriminate DES from E2 in terms of developmental toxicity, but at the same time do not capture the full mode of action underlying DES-induced developmental toxicity. Finally, it was shown that in addition to the subtle differences in toxicodynamics, substantial differences in internal concentrations (endogenous E2 concentrations compared to predicted DES concentrations in women that took DES as medication), add to the differential in vivo effects of E2 and DES.","auteur":"Aziza Hussein","auteur_slug":"aziza-hussein","publicatiedatum":"20 april 2020","taal":"EN","url_flipbook":"https:\/\/ebook.proefschriftmaken.nl\/ebook\/azizahussein?iframe=true","url_download_pdf":"https:\/\/ebook.proefschriftmaken.nl\/download\/bc8fa037-6aa4-47bc-9e43-81eb36b1cf6c\/optimized","url_epub":"","ordernummer":"FTP-202603310850","isbn":"978-94-6395-369-6","doi_nummer":"","naam_universiteit":"Wageningen University","afbeeldingen":5804,"naam_student:":"","binnenwerk":"","universiteit":"Wageningen University","cover":"","afwerking":"","cover_afwerking":"","design":""},"_links":{"self":[{"href":"https:\/\/www.proefschriftmaken.nl\/en\/wp-json\/wp\/v2\/us_portfolio\/5802","targetHints":{"allow":["GET"]}}],"collection":[{"href":"https:\/\/www.proefschriftmaken.nl\/en\/wp-json\/wp\/v2\/us_portfolio"}],"about":[{"href":"https:\/\/www.proefschriftmaken.nl\/en\/wp-json\/wp\/v2\/types\/us_portfolio"}],"author":[{"embeddable":true,"href":"https:\/\/www.proefschriftmaken.nl\/en\/wp-json\/wp\/v2\/users\/8"}],"replies":[{"embeddable":true,"href":"https:\/\/www.proefschriftmaken.nl\/en\/wp-json\/wp\/v2\/comments?post=5802"}],"version-history":[{"count":1,"href":"https:\/\/www.proefschriftmaken.nl\/en\/wp-json\/wp\/v2\/us_portfolio\/5802\/revisions"}],"predecessor-version":[{"id":5805,"href":"https:\/\/www.proefschriftmaken.nl\/en\/wp-json\/wp\/v2\/us_portfolio\/5802\/revisions\/5805"}],"wp:featuredmedia":[{"embeddable":true,"href":"https:\/\/www.proefschriftmaken.nl\/en\/wp-json\/wp\/v2\/media\/5803"}],"wp:attachment":[{"href":"https:\/\/www.proefschriftmaken.nl\/en\/wp-json\/wp\/v2\/media?parent=5802"}],"wp:term":[{"taxonomy":"us_portfolio_category","embeddable":true,"href":"https:\/\/www.proefschriftmaken.nl\/en\/wp-json\/wp\/v2\/us_portfolio_category?post=5802"}],"curies":[{"name":"wp","href":"https:\/\/api.w.org\/{rel}","templated":true}]}}