{"id":27076,"date":"2026-10-06T03:03:02","date_gmt":"2026-10-06T01:03:02","guid":{"rendered":"https:\/\/www.proefschriftmaken.nl\/portfolio\/linda-van-den-berk\/"},"modified":"2026-10-31T11:36:25","modified_gmt":"2026-10-31T10:36:25","slug":"linda-van-den-berk","status":"publish","type":"us_portfolio","link":"https:\/\/www.proefschriftmaken.nl\/en\/portfolio\/linda-van-den-berk\/","title":{"rendered":"Linda van den Berk"},"content":{"rendered":"","protected":false},"featured_media":27077,"template":"","meta":{"_acf_changed":false},"university_us_portfolio":[22],"class_list":["post-27076","us_portfolio","type-us_portfolio","status-publish","has-post-thumbnail","hentry","university_us_portfolio-universiteit-leiden"],"acf":{"main_text":"","naam_van_het_proefschift":"Advanced models for inflammation-dependent drug-induced organ toxicity","samenvatting":"Het optreden van ernstige bijwerkingen is een van de belangrijkste oorzaken dat een medicijn de markt niet bereikt of na het goedkeuren wordt teruggetrokken. De lever, de nieren, en het hart worden vaak getroffen door bijwerkingen en de schade die hierbij ontstaat is in veel gevallen onomkeerbaar. De meeste bijwerkingen ontstaan door gebruik van een medicijn in een te hoge dosis en zijn daardoor redelijk voorspelbaar. Bij een zeer klein deel van de pati\u00ebnten ontstaat de toxiciteit echter ook bij normaal gebruik; dit wordt idiosyncratische toxiciteit genoemd. Er zijn meerdere oorzaken van idiosyncratische toxiciteit, waaronder interacties tussen het medicijn en pati\u00ebnt-afhankelijke factoren, zoals genetische opmaak van een individu, de aanwezigheid van onderliggende ziekten en ontstekingsreacties. Medicijnen die ernstige idiosyncratische toxiciteit veroorzaken worden minder vaak voorgeschreven en krijgen een extra zware waarschuwing in de bijsluiter. Het is belangrijk om onderzoek te doen naar de mechanismes die leiden tot deze bijwerkingen, om zo in een vroeg stadium te kunnen voorspellen of een pati\u00ebnt gevoelig is voor deze toxiciteit met als doel om uiteindelijke orgaanschade te voorkomen.\n\nDe meeste medicijnen activeren bepaalde processen, zogenaamde adaptieve stress responsen, om organen te beschermen tegen schade. Als de schade binnen de perken blijft, dan kan een cel hiervan herstellen. Echter, wanneer de schade een drempelwaarde heeft bereikt, dan zal deze overschakelen op specifieke celdood programma\u2019s. Zowel stress, celdood, als een onderliggende infectie kunnen zorgen dat een bepaald type immuun cellen, genaamd macrofagen, het ontstekingsbevorderende eiwit TNF-\u03b1 gaan produceren. In een gezonde of minimaal gestreste cel kan TNF-\u03b1 overleving bevorderen via de activatie van de transcriptie factor NF-\u03baB. In het geval van een door medicijngebruik zeer gestreste cel, kan de aanwezigheid van TNF-\u03b1 deze balans verstoren en leiden tot celdood.\n\nOm vroeg in de ontwikkeling van een medicijn vast te stellen of een geneesmiddel bepaalde stress veroorzaakt, zijn preklinische experimenten nodig. Er zijn verschillende soorten preklinische weefselkweek modellen beschikbaar om geneesmiddelen op te testen. Echter voor het specifiek bestuderen van TNF-\u03b1 ge\u00efnduceerde stress, is een preklinisch model nodig dat goed reageert op dit ontstekingseiwit om met een zo\u2019n groot mogelijke kans dit type bijwerking op te pikken in het laboratorium.\n\nEen relatief nieuwe categorie modellen voor het bestuderen van orgaanontwikkeling, ziekte en toxiciteit is gecentreerd rond het gebruik van pluripotente stamcellen. Deze stamcellen zijn geherprogrammeerd vanuit een somatische cel bijvoorbeeld uit de huid, urine of het bloed en hebben de capaciteit om vervolgens te differenti\u00ebren in elke cel van het lichaam. Door de embryonale ontwikkeling buiten het lichaam na te bootsen kunnen bijvoorbeeld hepatocyten (lever), cardiomyocyten (hart) en de proximale tubulus (nier) gemaakt worden en vervolgens kunnen deze cellen blootgesteld worden aan geneesmiddelen om de medicijnveiligheid te bestuderen.\n\nIn dit proefschrift hebben we verschillende preklinische modellen vergeleken en gebruikt voor het meten van (TNF-\u03b1 ge\u00efnduceerde) stress om zo te bepalen welk model het meest bruikbaar is voor ons in het lab.\n\nIn hoofdstuk 2 hebben we gekeken of een bestaand model dat gebruikt maakt van HepG2 lever carcinoomcellen relevanter gemaakt kan worden. Onder 2D kweekomstandigheden hebben deze kankercellen een lage expressie van eiwitten die essentieel zijn voor het omzetten van geneesmiddelen. Door HepG2 cellen in 3D te kweken in Matrigel wordt de expressie van dit soort eiwitten belangrijk voor metabolisme van een medicijn verhoogd. Matrigel is echter afkomstig uit muizentumoren en is er erg veel variabiliteit tussen verschillende Matrigel batches, waardoor de reproduceerbaarheid niet gegarandeerd kan worden. Door Matrigel te vervangen door een zelf gesynthetiseerde gel met arginylglycylaspartic acid (RGD) peptiden konden we 3D sfero\u00efden genereren met een beter metabolisme dan de sfero\u00efden die in Matrigel werden gemaakt, gebaseerd op de expressie van verschillende enzymen, medicijntransporters en andere essenti\u00eble markers die van belang zijn in de lever. Het lijkt erop dat deze nieuwe gel een goed alternatief is om HepG2 sfero\u00efden te maken, maar de toekomst zal moeten blijken of dit nieuwe model ook beter is in het voorspellen van toxiciteit na blootstelling aan geneesmiddelen.\n\nVoor het voorspellen van immuun-gemedieerde toxiciteit is een levermodel nodig dat goed reageert op pro-inflammatoire eiwitten. Daarom hebben we in hoofdstuk 3 beoordeeld hoe vijf verschillende lever modellen reageren op verschillende immuun-gerelateerde cytokines, zoals TNF-\u03b1, IL-1\u03b2, IL-6, IL-10, IL-12, en IL-18. De verschillende levermodellen bestonden uit primaire humane hepatocyten, die als de goudstandaard worden gezien binnen het onderzoek naar bijwerkingen van geneesmiddelen in de lever. Daarnaast hebben we HepG2 kankercellen gekweekt in 2 verschillende celkweek media en hebben we pluripotente stamcellen gedifferentieerd naar hepatocyten. Het laatste model bestond uit sfero\u00efden bestaande uit meerdere celtypen (hepatocyten, stellaat cellen en Kupffer cellen) die aanwezig zijn in de lever om zo nog beter de lever na te bootsten. Op basis van TempO-seq analyse, een gerichte RNA sequencing techniek, hadden de meeste cytokines, inclusief IL-6, IL-10, IL-12 en IL-18, een minimaal effect op al deze levermodellen. Het pro-inflammatoire cytokine IL-1\u03b2 zorgde voor een respons in alle vijf de levermodellen, maar we konden geen verschil opmerken in de mate van reactie. Wanneer we echter het effect van TNF-\u03b1 bestudeerden, konden we verschillen opmerken in de mate waarop een lever model reageert. Primaire humane hepatocyten reageerden veel minder sterk op TNF-\u03b1 vergeleken met de andere modellen en daardoor konden we concluderen dat deze primaire hepatocyten niet het meest geschikte model zijn om de interactie van een medicijn en TNF-\u03b1 te onderzoeken. Hepatocyten gemaakt van pluripotente stamcellen lieten daarentegen een soortgelijke, maar vele malen sterkere respons zien op TNF-\u03b1 vergeleken met primaire hepatocyten. Daarom hebben we vervolgens in het stamcelmodel verder onderzocht of niet-stero\u00efde anti-inflammatoire middelen (NSAIDs) en TNF-\u03b1 met elkaar interacteren en de immuun-gerelateerde stress induceren. Uiteindelijk konden we concluderen dat deze interactie en bijkomende celdood was zoals verwacht met verschillende NSAIDs waarvan al bekend was dat ze immuun-ge\u00efnduceerde levertoxiciteit veroorzaken.\n\nAangezien we in hoofdstuk 3 hebben laten zien dat hepatocyten gemaakt van pluripotente stamcellen goed reageren op immunomodulatoren, besloten we dat dit het beste model was om de interactie van een geneesmiddel en TNF-\u03b1 verder te onderzoeken op grotere groepen medicijnen. Dit is doorgaans een duur en tijdrovend proces. Idealiter zou de mogelijke toxiciteit van deze kandidaat geneesmiddelen snel en goedkoop bepaald moeten kunnen worden aan de hand van de activatie van stress responses eiwitten, zoals het geval is bij bijvoorbeeld inflammatie. Om te bepalen of er inflammatie optreedt kunnen we pluripotente stamcellen gebruiken waar bepaalde eiwitten gekoppeld zijn aan een fluorescent eiwit, deze vervolgens differenti\u00ebren naar hepatocyten en vervolgens blootstellen aan een kandidaat geneesmiddel en TNF-\u03b1. Onder de confocale microscoop kleuren deze cellen vervolgens groen op en kunnen we bepalen of er inflammatie is opgetreden. In hoofdstuk 4 van dit proefschrift beschrijven we een methode om op een systematische manier genen te identificeren die ge\u00efnduceerd worden tijdens inflammatie in de lever. A20, LCN2, RND1, IRF1, VCAM1 en ICAM1 werden uiteindelijk geselecteerd als specifieke inflammatoire biomarkers en het fluorescente eiwit eGFP werd gekoppeld aan deze eiwitten om de cel te doen laten oplichten wanneer er inflammatie optreedt. Voor A20, IRF1, VCAM1 en ICAM1 hebben we op een succesvolle manier laten zien dat deze manier van het koppelen van een fluorescent eiwit aan een biomarker werkt in pluripotente stamcellen. Daarnaast kleurden deze cellen ook op wanneer ze werden gedifferentieerd naar hepatocyten. Ten slotte beschreven we dat deze biomarkers niet alleen inflammatie in de lever ontrafelen, maar dat deze fluorescerende pluripotente stamcellen ook gedifferentieerd konden worden naar cardiomyocyten om de activatie van inflammatoire verdedigingsmechanismen aan te tonen.\n\nDe bruikbaarheid van deze fluorescerende stamcellen hebben we verder aangetoond in hoofdstuk 5. Hier hebben we stamcellen waar het inflammatoire eiwit ICAM1 is gekoppeld aan eGFP gedifferentieerd naar hepatocyten, cardiomyocyten en de proximale tubulus cellen van de nier. Vervolgens hebben we deze cellen behandeld met een relatief nieuwe groep kandidaat geneesmiddelen genaamd kinase remmers (760 kandidaten) en TNF-\u03b1. We hebben als een van de eersten laten zien dat het screenen van zo\u2019n grote set medicijnen mogelijk is met stamcel model. Deze screen heeft aangetoond dat er veel overlap zit tussen geneesmiddelen die de expressie van ICAM1 blokkeren in de verschillende celtypen. Echter, wanneer we kijken naar kandidaten die de expressie van ICAM1, en dus inflammatie, verhogen, dan zien we bijna geen gelijkenis tussen deze kandidaat geneesmiddelen en de verschillende celtypen. Vervolgens hebben we ons verder verdiept in kandidaten die de expressie van ICAM1 verhogen in de proximale tubulus van de nier, aangezien dit wordt geassocieerd met het aantrekken en activeren van immuun cellen die verdere schade aan cellen en organen kunnen veroorzaken. We hebben gevalideerd dat kinase remmers die in klinische trials ook voor verhoogde inflammatie in de nier zorgen, ook ge\u00efdentificeerd konden worden in onze screen. Daarnaast hebben we op moleculair niveau laten zien dat dit mogelijk komt door de verhoogde uitscheiding van bepaalde pro-inflammatoire chemokines die verantwoordelijk zijn voor het aantrekken van immuun cellen die op deze manier verdere inflammatie en mogelijke schade stimuleren. Ten slotte beschrijven we dat deze kinase remmers vaak niet specifiek een kinase eiwit remmen, maar dat ze vaak off-target effecten hebben en daardoor mogelijk voor meer bijwerkingen zorgen. Dit benadrukt het belang om in vroege stadia van geneesmiddelontwikkeling al te kunnen voorspellen of een kandidaat wel of niet voor bijwerkingen zorgt.\n\nIn dit proefschrift hebben we beschreven hoe we het meest relevante preklinische model om immuun-gerelateerde toxiciteiten in de lever, nieren en het hart kunnen identificeren. Het gebruik van fluorescente reporters voor inflammatie in pluripotente stamcellen en de gedifferentieerde celtypen hiervan dragen hieraan bij. Daarnaast kunnen we met deze preklinische experimenten grote groepen nieuwe geneesmiddelen op een relatief eenvoudige manier testen. Aan de hand van deze uitkomsten kunnen andere vervolg testen worden gedaan die bijdragen aan een breder inzicht van de moleculaire mechanismen achter deze toxiciteiten. Dit draagt bij aan het goedkoop en sneller detecteren van mogelijke bijwerkingen in vroege fases van medicijnontwikkeling en op deze manier zullen nieuwe geneesmiddelen hopelijk in de toekomst sneller op de markt verschijnen.","summary":"The occurrence of serious side effects is one of the main reasons that a drug does not reach the market or is withdrawn after approval. The liver, kidneys, and heart are often affected by side effects, and the damage caused is often irreversible. Most side effects arise from using a drug at too high a dose and are therefore reasonably predictable. However, in a very small portion of patients, toxicity also occurs during normal use; this is called idiosyncratic toxicity. There are multiple causes of idiosyncratic toxicity, including interactions between the drug and patient-dependent factors such as an individual's genetic makeup, the presence of underlying diseases, and inflammatory reactions. Drugs that cause serious idiosyncratic toxicity are prescribed less frequently and receive a severe warning in the package leaflet. It is important to research the mechanisms leading to these side effects to predict at an early stage whether a patient is sensitive to this toxicity, with the aim of preventing eventual organ damage.\n\nMost medications activate certain processes, known as adaptive stress responses, to protect organs from damage. If the damage remains within limits, a cell can recover. However, when the damage reaches a threshold, it will switch to specific cell death programs. Both stress, cell death, and an underlying infection can cause a certain type of immune cells, called macrophages, to produce the pro-inflammatory protein TNF-\u03b1. In a healthy or minimally stressed cell, TNF-\u03b1 can promote survival via the activation of the transcription factor NF-\u03baB. In the case of a cell highly stressed by drug use, the presence of TNF-\u03b1 can disturb this balance and lead to cell death.\n\nTo determine early in drug development whether a drug causes certain stress, preclinical experiments are needed. Various types of preclinical tissue culture models are available to test medicines. However, for specifically studying TNF-\u03b1-induced stress, a preclinical model is needed that responds well to this inflammatory protein to maximize the chance of picking up this type of side effect in the laboratory.\n\nA relatively new category of models for studying organ development, disease, and toxicity is centered around the use of pluripotent stem cells. These stem cells are reprogrammed from a somatic cell, for example, from skin, urine, or blood, and have the capacity to subsequently differentiate into any cell of the body. By mimicking embryonic development outside the body, hepatocytes (liver), cardiomyocytes (heart), and the proximal tubule (kidney) can be created and then exposed to drugs to study drug safety.\n\nIn this thesis, we compared various preclinical models and used them to measure (TNF-\u03b1-induced) stress to determine which model is most useful for us in the lab.\n\nIn Chapter 2, we looked at whether an existing model using HepG2 liver carcinoma cells could be made more relevant. Under 2D culture conditions, these cancer cells have low expression of proteins essential for drug conversion. By culturing HepG2 cells in 3D in Matrigel, the expression of such proteins important for drug metabolism is increased. However, Matrigel originates from mouse tumors and exhibits significant variability between different batches, meaning reproducibility cannot be guaranteed. By replacing Matrigel with a self-synthesized gel containing arginylglycylaspartic acid (RGD) peptides, we were able to generate 3D spheroids with better metabolism than those made in Matrigel, based on the expression of various enzymes, drug transporters, and other essential markers relevant in the liver. This new gel seems to be a good alternative for creating HepG2 spheroids, but future research must determine whether this new model is also better at predicting toxicity after drug exposure.\n\nTo predict immune-mediated toxicity, a liver model is needed that responds well to pro-inflammatory proteins. Therefore, in Chapter 3, we assessed how five different liver models react to different immune-related cytokines, such as TNF-\u03b1, IL-1\u03b2, IL-6, IL-10, IL-12, and IL-18. The various liver models consisted of primary human hepatocytes, considered the gold standard in research into drug side effects in the liver. We also cultured HepG2 cancer cells in two different culture media and differentiated pluripotent stem cells into hepatocytes. The final model consisted of spheroids composed of multiple cell types (hepatocytes, stellate cells, and Kupffer cells) present in the liver to better mimic the liver. Based on TempO-seq analysis, a targeted RNA sequencing technique, most cytokines, including IL-6, IL-10, IL-12, and IL-18, had a minimal effect on all these liver models. The pro-inflammatory cytokine IL-1\u03b2 caused a response in all five liver models, but we could not observe a difference in the degree of reaction. However, when we studied the effect of TNF-\u03b1, we could notice differences in how a liver model reacts. Primary human hepatocytes reacted much less strongly to TNF-\u03b1 compared to the other models, leading us to conclude that these primary hepatocytes are not the most suitable model for investigating the interaction between a drug and TNF-\u03b1. In contrast, hepatocytes made from pluripotent stem cells showed a similar but many times stronger response to TNF-\u03b1 compared to primary hepatocytes. Therefore, we subsequently further investigated in the stem cell model whether non-steroidal anti-inflammatory drugs (NSAIDs) and TNF-\u03b1 interact and induce immune-related stress. Ultimately, we concluded that this interaction and the accompanying cell death were as expected with several NSAIDs already known to cause immune-induced liver toxicity.\n\nSince we showed in Chapter 3 that hepatocytes made from pluripotent stem cells respond well to immunomodulators, we decided this was the best model to further investigate the interaction of a drug and TNF-\u03b1 on larger groups of medicines. This is usually an expensive and time-consuming process. Ideally, the potential toxicity of these candidate drugs should be determined quickly and cheaply based on the activation of stress response proteins, as is the case with inflammation. To determine if inflammation occurs, we can use pluripotent stem cells where certain proteins are linked to a fluorescent protein, differentiate these into hepatocytes, and then expose them to a candidate drug and TNF-\u03b1. Under a confocal microscope, these cells then light up green, and we can determine if inflammation has occurred. In Chapter 4 of this thesis, we describe a method to systematically identify genes induced during inflammation in the liver. A20, LCN2, RND1, IRF1, VCAM1, and ICAM1 were eventually selected as specific inflammatory biomarkers, and the fluorescent protein eGFP was linked to these proteins to make the cell light up when inflammation occurs. For A20, IRF1, VCAM1, and ICAM1, we successfully demonstrated that this method of linking a fluorescent protein to a biomarker works in pluripotent stem cells. Additionally, these cells lit up when differentiated into hepatocytes. Finally, we described that these biomarkers not only unravel inflammation in the liver but that these fluorescent pluripotent stem cells could also be differentiated into cardiomyocytes to demonstrate the activation of inflammatory defense mechanisms.\n\nWe further demonstrated the utility of these fluorescent stem cells in Chapter 5. Here, we differentiated stem cells where the inflammatory protein ICAM1 is linked to eGFP into hepatocytes, cardiomyocytes, and proximal tubule cells of the kidney. We then treated these cells with a relatively new group of candidate drugs called kinase inhibitors (760 candidates) and TNF-\u03b1. We were among the first to show that screening such a large set of medicines is possible with a stem cell model. This screen showed significant overlap between drugs that block ICAM1 expression in the different cell types. However, when looking at candidates that increase ICAM1 expression, and thus inflammation, we see almost no similarity between these candidate drugs and the different cell types. Subsequently, we delved deeper into candidates that increase ICAM1 expression in the proximal tubule of the kidney, as this is associated with attracting and activating immune cells that can cause further damage to cells and organs. We validated that kinase inhibitors which cause increased kidney inflammation in clinical trials were also identified in our screen. Additionally, we showed at a molecular level that this is likely due to the increased secretion of certain pro-inflammatory chemokines responsible for attracting immune cells that stimulate further inflammation and possible damage. Finally, we describe that these kinase inhibitors often do not inhibit a kinase protein specifically but often have off-target effects and therefore potentially cause more side effects. This highlights the importance of being able to predict in early stages of drug development whether a candidate will cause side effects.\n\nIn this thesis, we have described how we can identify the most relevant preclinical model for immune-related toxicities in the liver, kidneys, and heart. The use of fluorescent reporters for inflammation in pluripotent stem cells and their differentiated cell types contributes to this. Furthermore, we can test large groups of new medicines in a relatively simple way with these preclinical experiments. Based on these outcomes, other follow-up tests can be performed that contribute to a broader insight into the molecular mechanisms behind these toxicities. This contributes to the cheap and rapid detection of potential side effects in early stages of drug development, and in this way, new medicines will hopefully appear on the market faster in the future.","auteur":"Linda van den Berk","auteur_slug":"linda-van-den-berk","publicatiedatum":"11 november 2026","taal":"NL","url_flipbook":"https:\/\/ebook.proefschriftmaken.nl\/ebook\/lindavandenberk?iframe=true","url_download_pdf":"https:\/\/ebook.proefschriftmaken.nl\/download\/d97f372a-3ab7-49d5-8cbe-221bec8d0bcb\/highres","url_epub":"","ordernummer":"19633","isbn":"978-94-6534-703-5","doi_nummer":"","naam_universiteit":"Universiteit Leiden","afbeeldingen":27077,"video_url":"","podcast_url":"","naam_student:":"","binnenwerk":"","universiteit":"Universiteit Leiden","cover":"","afwerking":"","cover_afwerking":"","design":""},"_links":{"self":[{"href":"https:\/\/www.proefschriftmaken.nl\/en\/wp-json\/wp\/v2\/us_portfolio\/27076","targetHints":{"allow":["GET"]}}],"collection":[{"href":"https:\/\/www.proefschriftmaken.nl\/en\/wp-json\/wp\/v2\/us_portfolio"}],"about":[{"href":"https:\/\/www.proefschriftmaken.nl\/en\/wp-json\/wp\/v2\/types\/us_portfolio"}],"wp:featuredmedia":[{"embeddable":true,"href":"https:\/\/www.proefschriftmaken.nl\/en\/wp-json\/wp\/v2\/media\/27077"}],"wp:attachment":[{"href":"https:\/\/www.proefschriftmaken.nl\/en\/wp-json\/wp\/v2\/media?parent=27076"}],"wp:term":[{"taxonomy":"university_us_portfolio","embeddable":true,"href":"https:\/\/www.proefschriftmaken.nl\/en\/wp-json\/wp\/v2\/university_us_portfolio?post=27076"}],"curies":[{"name":"wp","href":"https:\/\/api.w.org\/{rel}","templated":true}]}}