{"id":16837,"date":"2026-08-20T17:30:55","date_gmt":"2026-08-20T15:30:55","guid":{"rendered":"https:\/\/www.proefschriftmaken.nl\/portfolio\/marijn-van-den-brink\/"},"modified":"2026-08-20T17:31:04","modified_gmt":"2026-08-20T15:31:04","slug":"marijn-van-den-brink","status":"publish","type":"us_portfolio","link":"https:\/\/www.proefschriftmaken.nl\/en\/portfolio\/marijn-van-den-brink\/","title":{"rendered":"Marijn van den Brink"},"content":{"rendered":"","protected":true},"excerpt":{"rendered":"","protected":true},"author":8,"featured_media":16838,"comment_status":"closed","ping_status":"closed","template":"","meta":{"_acf_changed":false,"footnotes":""},"us_portfolio_category":[45],"class_list":["post-16837","us_portfolio","type-us_portfolio","status-publish","post-password-required","hentry","us_portfolio_category-new-template"],"acf":{"main_text":"","naam_van_het_proefschift":"Laboratory evolution of synthetic cells","samenvatting":"Het doel van deze thesis was het onderzoeken van methodologie\u00ebn die het bouwen van een minimale, synthetische cel versnellen. Dit werd bereikt door het maken van gerichte combinatorische DNA libraries, door deze te onderwerpen aan verschillende screening- en selectiemethoden, en door nanopore sequencing analyses en visualisatiemethodes te verkennen die DNA sequentie aan systeemfunctie koppelen.\n\nGedurende miljarden jaren evolutie hebben zelfs de eenvoudigste cellen buitengewoon complexe genetische architectuur, ruimtelijke organisaties en moleculaire interacties opgebouwd. Deze complexiteit maakt het moeilijk om de rol van elk afzonderlijk element in de cel te ontdekken. Wat als we zelf een cel zouden kunnen maken waarbij we alle niet-essenti\u00eble complexiteit weglaten? Een minimale versie van een cel, bestaande uit goed gekarakteriseerde onderdelen, zou inzicht kunnen geven in welke cellulaire processen essentieel zijn voor leven en hoe interacties tussen genen en eiwitten leiden tot het uiteindelijke gedrag van een cel. Dat is het doel van het bouwen van een minimale, synthetische cel die in staat is zichzelf te repliceren, te onderhouden en te evolueren.\n\nHet bouwen van een cel zonder dat een bouwtekening beschikbaar is, vereist het voortdurend schakelen tussen het testen van prototypes en daarvan leren om weer nieuwe prototypes te kunnen ontwerpen. Om deze onderzoeksmethodiek te versnellen, stellen we dat de rationele aanpak van prototypering moet worden aangevuld met methoden die grote aantallen prototypes, vaak (gedeeltelijk) willekeurig gegenereerd, tegelijk kunnen testen. Directed evolution (ook wel gedirigeerde evolutie of laboratoriumevolutie genoemd) is zo\u2019n methode: een breed ontwikkelde techniek voor het optimaliseren van eiwitten, die enorm veel prototypes tegelijk kan testen. In ons lab bestaat het moleculaire framework van synthetische cellen uit liposomen waarin genen tot expressie komen doordat de liposomen DNA en een gezuiverd cel-vrij expressiesysteem (PURE system) bevatten. Hoofdstuk 1 van deze thesis bespreekt de huidige mogelijkheden van directed evolution methoden voor het engineeren van zulke in vitro moleculaire frameworks. Dit overzicht laat zien dat directed evolution vooral is toegepast voor het optimaliseren van individuele eiwitten, maar nauwelijks voor het engineeren van in vitro systemen bestaande uit meerdere eiwitten. We identificeren de volgende uitdagingen bij het toepassen van directed evolution voor het bouwen van een synthetische cel: (i) de omvang van de ontwerpruimte, (ii) het kiezen van optimalisatie-targets en (iii) het ontbreken van spatiotemporele screening- en sorteermethoden voor liposomen die tijdsafhankelijke, morfologische of localisatie-eigenschappen vertonen. De volgende hoofdstukken laten zien hoe deze uitdagingen kunnen worden aangegaan.\n\nHoofdstuk 2 introduceert een nieuw protocol voor het construeren van gerichte combinatorische plasmide libraries, genaamd MOSAIC. Traditionele protocollen voor het muteren van plasmiden, die afhankelijk zijn van DNA-amplificatie en\/of kloneringsstappen, kunnen arbeidsintensief zijn wanneer veel plaatsen op \u00e9\u00e9n DNA-molecuul moeten worden gemuteerd. Daarom hebben we een methode voor het muteren van het Escherichia coli genoom \u2013 die meerdere loci tegelijk kan muteren \u2013 aangepast voor een nieuw doel: het muteren van plasmiden. Een target plasmide en DNA oligo\u2019s met de gewenste mutaties werden samen via elektroporatie ingebracht in E. coli cellen die het enkelstrengs DNA-annealingeiwit CspRecT (afkomstig van een bacteriofaag) tot expressie brengen. Tijdens replicatie van het plasmide medieert CspRecT de annealing van de oligo\u2019s aan het plasmide-DNA in de replicatievork, wat leidt tot de incorporatie van mutaties (mismatches, inserties of deleties) met een effici\u00ebntie van 50-90% per mutatie-plek. Een combinatorische DNA library werd geconstrueerd met behulp van een oligo library die vier posities tegelijk target. Deze library werd gekarakteriseerd met long-read nanopore sequencing, waarbij kwaliteitscontrole werd toegepast op de gemuteerde regio\u2019s.\n\nHoofdstuk 3 onderzoekt de impact van het veranderen van eiwittranslatie\u2011initiatie snelheden op de activiteit van DNA-gecodeerde eiwitsystemen. Met behulp van MOSAIC werden gerichte combinatorische libraries geconstrueerd voor een DNA\u2011zelfreplicator bestaande uit twee genen en een fosfolipidesyntheseroute bestaande uit vier genen. Voor de DNA\u2011replicator werden de best presterende varianten geselecteerd uit een library van 156 varianten met verschillende ribosoombindingsplaats (RBS) sequenties. Selectie gebeurde op basis van hun superieure zelfamplificatie. Voor de fosfolipidesyntheseroute werden twee libraries \u2013 een RBS\u2011library van 104 varianten en een library van 108 varianten waarin de eerste zes codons van de vier genen waren gemuteerd \u2013 gescreend en de topvarianten gesorteerd via fluorescence-activated cell sorting (FACS). Nanopore sequencing maakte het mogelijk om fitnesslandschappen te reconstrueren waarin DNA\u2011sequenties worden gekoppeld aan de activiteit van de eiwitsystemen. Deze landschappen boden inzicht in optimale RBS\u2011sterktes en basensubstituties, en onthulden welke genen de functionaliteit van de eiwitsystemen het meest konden moduleren. Omdat de DNA libraries combinatorisch waren, konden we ook combinaties van mutaties bestuderen. De theoretische fitness van combinatorische varianten was zeer voorspellend voor de DNA\u2011replicator library, wat wijst op het ontbreken van epistatische interacties tussen de RBS\u2019en van de twee replicatiegenen. De voorspelbaarheid was lager voor de grotere fosfolipidesyntheseroute libraries. Al met al hebben we laten zien hoe combinatorisch testen kan worden uitgebreid van individuele eiwitten naar systemen bestaande uit meerdere eiwitten, en dat het veranderen van translatie\u2011initiatie snelheden een effectieve manier is om DNA\u2011replicatie en fosfolipidesynthese te moduleren op systeemniveau.\n\nHoofdstuk 4 beschrijft een methode voor het sorteren van synthetische cellen op basis van hun fenotypes verkregen via foto\u2019s. Deze methode onderzoekt de fenotypes van liposomen binnen niet-klonale populaties via microscopie. De gewenste varianten worden gemarkeerd door de fluorescentie van een eiwit te activeren met UV licht. Vervolgens worden de gemarkeerde liposomen gesorteerd door FACS. Door het automatiseren van optische microscopie en machine learning-geassisteerde analyse van de foto\u2019s, demonstreerden we het screenen van 105-106 liposomen per dag, waarvan 100-1000 werden gesorteerd met een precisie van 80%. Aan de hand van een in vitro gereconstitueerde bacteri\u00eble eiwitoscillator, het Min-systeem, toonden we aan dat liposomen geselecteerd kunnen worden op basis van fluorescentie-intensiteit, eiwitlocalisatie, membraanmorfologie en dynamische fenotypes, en dat het fenotype kan worden gekoppeld aan de genetische inhoud van de liposomen. Al met al vergroot deze methode het scala aan fenotypes op basis waarvan liposomen kunnen worden gesorteerd en is daarom essentieel voor laboratoriumevolutie van synthetische cellen.\n\nDoor onderlinge afhankelijkheden tussen het DNA en de moleculaire hardware van synthetische cellen (het expressiesysteem) is een co\u2011optimalisatiestrategie waarschijnlijk essentieel voor het bouwen van een synthetische cel. Hoofdstuk 5 beschrijft een co\u2011optimalisatiestrategie die door middel van DNA\u2011barcoding de moleculaire samenstelling identificeert. De moleculaire samenstelling verwijst hier naar de componenten van het cytoplasma (bestaande voornamelijk uit het expressiesysteem) en het membraan. We schatten dat deze strategie het mogelijk zal maken om met FACS in \u00e9\u00e9n dag een library van 103-104 DNA\u2011varianten te screenen in combinatie met 30-100 moleculaire varianten. Via proof\u2011of\u2011conceptexperimenten met wildtype DNA valideerden we dat de barcodes geen bias veroorzaken in het verrijken van topvarianten en dat ze de goed presterende moleculaire samenstellingen kunnen identificeren. Een gestroomlijnde productiemethode van liposomen met verschillende genetische en moleculaire inhoud, en het toepassen van active learning om de grote variabele ruimte en de relatief beperkte experimentele capaciteit te overbruggen, zullen de bruikbaarheid van de ontwikkelde strategie in de toekomst kunnen aantonen.\n\nTot slot beschrijft Hoofdstuk 6 de toekomstige perspectieven op laboratoriumevolutie van synthetische cellen door drie methodologische verbeteringen uit te lichten. Ten eerste zullen niet alleen de best presterende varianten, maar ook varianten met lagere fitness gesorteerd moeten worden om hun (kwantitatieve) eigenschappen te analyseren. Ten tweede zou de karakterisering van synthetische cellen kunnen worden uitgebreid van alleen DNA\u2011sequencing naar multi\u2011omics analyses. Ten derde zou DNA amplificatie uit gesorteerde liposomen kunnen worden geoptimaliseerd voor een nauwkeurigere kwantificatie van variantfrequenties (fitness). Deze verbeteringen zullen de kennis die uit elke prototypingronde wordt verkregen vergroten, waardoor het aantal engineeringrondes dat nodig is om het einddoel te bereiken afneemt en de kans op het succesvol bouwen van een synthetische cel toeneemt.\n\nSamenvattend laat deze thesis zien hoe gericht combinatorisch testen kan worden toegepast voor de optimalisatie van in vitro gereconstitueerde systemen die uit meerdere genen bestaan. In toekomstig onderzoek kunnen de methoden die verkend zijn in deze thesis worden uitgebreid naar de laboratoriumevolutie van grotere synthetische genomen en uiteindelijk naar die van een volledige synthetische cel.","summary":"The aim of this thesis was to explore methodologies that accelerate the building of a minimal, synthetic cell. This was achieved by building targeted combinatorial DNA libraries, subjecting these to various screening and selection methods, and exploring nanopore sequencing analysis and visualization methods for sequence-function mapping.\n\nThroughout billions of years of evolution, even the simplest cells accumulated extraordinarily complex genetic architectures, spatial organizations and molecular interactions. This complexity makes it difficult to disentangle the role of each element in the cell. What if we could reconstruct a cell but leave out all unessential complexity? A minimal version of a cell, composed of well-characterized parts, would give insight into which cellular processes are essential for life and how interacting genes and proteins give rise to a cell\u2019s behaviors. This is the purpose of building a minimal, synthetic cell capable of self-replication, self-maintenance and evolution.\n\nBuilding a cell without a blueprint requires constantly going back and forth between prototyping and learning. To accelerate this research methodology, we postulate that the rational approach to prototyping must be complemented with randomness-leveraging methods with high exploratory powers. Directed evolution is such a method: a widely developed protein engineering method that can evaluate many prototypes in parallel. In our lab, the molecular framework of synthetic cells consists of liposomes capable of gene expression due to the encapsulation of DNA and a purified cell-free expression system (PURE system). Chapter 1 of this thesis outlines the current capabilities of directed evolution methods for the engineering of such in vitro molecular frameworks. This outline shows that directed evolution has been well established for optimizing single proteins but has barely been applied to the engineering of multi-protein systems in vitro. We identify the following challenges in applying directed evolution for building a synthetic cell: (i) the vastness of the design space, (ii) selecting the optimization targets, and (iii) the lack of spatiotemporal screening and sorting methods for vesicles that exhibit time-dependent morphological or localization features. The next chapters will address these challenges.\n\nChapter 2 introduces a new protocol for the construction of targeted combinatorial plasmid libraries named MOSAIC. Traditional protocols for plasmid editing that rely on DNA amplification and\/or cloning steps can be laborious when mutating many sites on one DNA template. Therefore, we adapted an Escherichia coli genome editing method, capable of introducing mutations at multiple sites at once, for a new purpose: mutating plasmids. A target plasmid and DNA oligos harboring the desired mutations were co-electroporated into E. coli expressing the bacteriophage-derived single-stranded DNA annealing protein CspRecT. During plasmid replication, CspRecT mediates the annealing of the oligos to the plasmid DNA at the replication fork, leading to the incorporation of mutations (mismatches, insertions or deletions) with 50-90% editing efficiency per target site. A combinatorial library was constructed using an oligo library targeting four sites at once. The library was characterized by long-read nanopore sequencing, applying quality control to the regions of interest.\n\nChapter 3 studies the impact of tuning protein translation initiation rates on the activity of DNA-encoded protein systems. Using MOSAIC, targeted combinatorial libraries were constructed for a two-gene self-replicator DNA and a four-gene phospholipid synthesis pathway. For the DNA replicator, the best-performing variants of a 156-variant ribosomal binding site (RBS) library were selected as the result of their superior self-amplification. For the phospholipid synthesis pathway, two libraries \u2013 one RBS library of 104 variants and one library of 108 variants in which the first six codons of the four genes were mutated \u2013 were screened and the top variants sorted by fluorescence-activated cell sorting (FACS). Nanopore sequencing enabled the reconstruction of experimental fitness landscapes mapping DNA sequences with system\u2019s level activities. These landscapes provided insights into the optimal RBS strengths and base substitutions and revealed which genes were most impactful in modulating the functionality of the protein systems. In addition, the combinatorial DNA library approach allowed for studying the effects of combinations of mutations. The theoretical fitness of combinatorial variants was very predictive for the DNA replicator library, indicating the absence of epistatic interactions between the RBSs of the two replication genes. The combinatorial variant fitness was less predictive for the larger phospholipid synthesis pathway libraries. Taken together, we exemplified how combinatorial testing can be expanded from single proteins to multiprotein systems, and we found that tuning protein translation initiation rates was effective in modulating DNA replication and phospholipid synthesis at the system\u2019s level.\n\nChapter 4 describes a method for the image-based phenotypic sorting of synthetic cells. This method explores the phenotypes of gene-expressing vesicles within nonclonal populations using microscopy. The desired variants are marked by photoactivating the fluorescence of an encapsulated protein and subsequently sorted by FACS. By automating optical microscopy and machine learning-assisted image analysis, we demonstrated the screening of up to 105-106 vesicles per day, of which 100-1000 were sorted with 80% precision. Using a reconstituted bacterial protein oscillator \u2013 the Min system \u2013 as a case study, we showed that vesicles can be selected based on fluorescence intensity, protein localization, membrane morphology and dynamic behaviors, and that their phenotype can be linked to genetic content. This approach greatly expands the set of phenotypes that can inform sorting decisions and is therefore key to the evolutionary engineering of synthetic cells.\n\nInterdependencies between the DNA and molecular hardware of synthetic cells (the cell-free expression system) suggest that a co-optimization approach is likely key to engineering synthetic cells. Chapter 5 describes the design of a co-optimization strategy exploiting DNA barcoding to identify the molecular composition. Here, the molecular composition refers to the components of the cytoplasm (mainly the cell-free expression system) and the membrane. We estimated that this strategy should enable the screening of libraries of 103-104 DNA variants in combination with 30-100 molecular variants by FACS per day. Using proof-of-concept experiments with a wild-type DNA template, we validated that the barcodes do not bias variant enrichment and allow the retrieval of well-performing molecular compositions. Streamlining the preparation of liposomes with distinct genetic and molecular contents and exploiting active learning to bridge the gap between the large search space and the relatively low experimental capacity are the next steps to further demonstrate the feasibility of this method.\n\nFinally, Chapter 6 describes the future perspectives on laboratory evolution of synthetic cells by identifying three methodological improvements. First, sorting should not be limited to the top performing variants only, but (quantitative) data should also be gained on lower-fitness variants. Second, synthetic cell characterization could be expanded from DNA sequencing to multiomics analysis. Third, DNA recovery from sorted liposomes could be optimized to enable more accurate quantification of variant frequencies. These improvements will strengthen our knowledge gained from each prototyping experiment, thereby reducing the number of engineering rounds required to reach the final goal, and eventually increasing the success rate of building a synthetic cell.\n\nTaken together, this thesis exemplifies how targeted combinatorial testing can be applied to the optimization of in vitro reconstituted multiprotein systems. In future research, the directed evolution methods explored in this work could be further exploited to enable the evolutionary engineering of larger synthetic genomes, and eventually an entire artificial cell.","auteur":"Marijn van den Brink","auteur_slug":"marijn-van-den-brink","publicatiedatum":"22 september 2026","taal":"EN","url_flipbook":"https:\/\/ebook.proefschriftmaken.nl\/ebook\/marijnvandenbrink?iframe=true","url_download_pdf":"https:\/\/ebook.proefschriftmaken.nl\/download\/870ab083-74d4-4da1-b8cf-387833d572e7\/highres","url_epub":"","ordernummer":"19406","isbn":"978-94-6384-998-2","doi_nummer":"","naam_universiteit":"Overig","afbeeldingen":16839,"video_url":"","podcast_url":"","naam_student:":"","binnenwerk":"","universiteit":"Overig","cover":"","afwerking":"","cover_afwerking":"","design":""},"_links":{"self":[{"href":"https:\/\/www.proefschriftmaken.nl\/en\/wp-json\/wp\/v2\/us_portfolio\/16837","targetHints":{"allow":["GET"]}}],"collection":[{"href":"https:\/\/www.proefschriftmaken.nl\/en\/wp-json\/wp\/v2\/us_portfolio"}],"about":[{"href":"https:\/\/www.proefschriftmaken.nl\/en\/wp-json\/wp\/v2\/types\/us_portfolio"}],"author":[{"embeddable":true,"href":"https:\/\/www.proefschriftmaken.nl\/en\/wp-json\/wp\/v2\/users\/8"}],"replies":[{"embeddable":true,"href":"https:\/\/www.proefschriftmaken.nl\/en\/wp-json\/wp\/v2\/comments?post=16837"}],"version-history":[{"count":1,"href":"https:\/\/www.proefschriftmaken.nl\/en\/wp-json\/wp\/v2\/us_portfolio\/16837\/revisions"}],"predecessor-version":[{"id":16840,"href":"https:\/\/www.proefschriftmaken.nl\/en\/wp-json\/wp\/v2\/us_portfolio\/16837\/revisions\/16840"}],"wp:featuredmedia":[{"embeddable":true,"href":"https:\/\/www.proefschriftmaken.nl\/en\/wp-json\/wp\/v2\/media\/16838"}],"wp:attachment":[{"href":"https:\/\/www.proefschriftmaken.nl\/en\/wp-json\/wp\/v2\/media?parent=16837"}],"wp:term":[{"taxonomy":"us_portfolio_category","embeddable":true,"href":"https:\/\/www.proefschriftmaken.nl\/en\/wp-json\/wp\/v2\/us_portfolio_category?post=16837"}],"curies":[{"name":"wp","href":"https:\/\/api.w.org\/{rel}","templated":true}]}}