{"id":16582,"date":"2026-08-05T16:49:21","date_gmt":"2026-08-05T14:49:21","guid":{"rendered":"https:\/\/www.proefschriftmaken.nl\/portfolio\/martijn-de-roij\/"},"modified":"2026-08-05T16:49:32","modified_gmt":"2026-08-05T14:49:32","slug":"martijn-de-roij","status":"publish","type":"us_portfolio","link":"https:\/\/www.proefschriftmaken.nl\/en\/portfolio\/martijn-de-roij\/","title":{"rendered":"Martijn de Roij"},"content":{"rendered":"","protected":true},"excerpt":{"rendered":"","protected":true},"author":7,"featured_media":16583,"comment_status":"closed","ping_status":"closed","template":"","meta":{"_acf_changed":false,"footnotes":""},"us_portfolio_category":[45],"class_list":["post-16582","us_portfolio","type-us_portfolio","status-publish","post-password-required","hentry","us_portfolio_category-new-template"],"acf":{"naam_van_het_proefschift":"Auxin Response Factor Proteolysis","samenvatting":"De overgang van het leven in water naar land vormt een van de meest ingrijpende evolutionaire gebeurtenissen in de geschiedenis van de aarde. Ongeveer 600 miljoen jaar geleden koloniseerden de voorouders van de huidige landplanten terrestrische habitats die aanvankelijk vijandig en grotendeels onbewoonbaar waren. Het succesvol koloniseren van deze leefomgevingen vereiste dat deze vroege planten nieuwe ontwikkelingsmechanismen evolueerden om met nieuwe omgevingsfactoren om te gaan. Het overwinnen van deze uitdagingen vereiste steeds complexere meercellige lichaamsstructuren, wat op zijn beurt de ontwikkeling van geavanceerde regulatoire netwerken noodzakelijk maakte die groei, cel differentiatie en reactie op omgevingssignalen konden co\u00f6rdineren.\n\nCentraal in de regulatie van plantontwikkeling staat het fytohormoon auxine, een signaalmolecuul dat een breed scala aan processen in planten aanstuurt, waaronder embryogenese, orgaanvorming, regeneratie en aanpassing aan de omgeving. Auxine fungeert als een positioneel signaal dat patroonvorming in weefsels, cellulaire identiteit en de timing van ontwikkelingsprocessen stuurt. Ondanks dat het chemisch gezien een relatief eenvoudig molecuul is, co\u00f6rdineert auxine een grote diversiteit aan ontwikkelingsprocessen gedurende de volledige levenscyclus van planten. Begrijpen hoe auxine deze complexe ontwikkelingsprocessen aanstuurt vormt daarom een grote, centrale vraag binnen de plantenbiologie.\n\nAuxinesignalering in landplanten wordt voornamelijk gemedieerd via de Nuclear Auxin Pathway (NAP), een transcriptioneel moleculair systeem dat veranderingen in intracellulaire auxineconcentraties vertaalt naar specifieke veranderingen in genexpressie. Cruciale componenten van de NAP zijn de AUXIN RESPONSE FACTOR (ARF) transcriptiefactoren, die binden aan DNA-elementen en reguleren daardoor de transcriptie van auxine-responsieve genen. Hun activiteit wordt be\u00efnvloed door Aux\/IAA remmer-eiwitten, die ARF-activiteit remmen in afwezigheid van auxine. Wanneer auxineniveaus toenemen, stimuleert auxine de interactie tussen Aux\/IAA-prote\u00efnen en het TIR1\/AFB-receptorcomplex, wat leidt tot afbraak van Aux\/IAA-prote\u00efnen via het 26S proteasoom. Het verwijderen van deze remmende Aux\/IAA-prote\u00efnen heft de repressie van ARF-transcriptiefactoren op, waardoor activatie van auxine-responsieve genexpressie mogelijk wordt.\n\nHoewel dit canonieke model een robuust kader vormt voor het begrijpen van auxinesignalering, en gedurende de afgelopen drie decennia grotendeels onveranderd is gebleven, beschouwt het ARF transcriptiefactoren grotendeels als statische componenten van de NAP waarvan de hoeveelheid voornamelijk wordt bepaald door genexpressie. De activiteit van een transcriptiefactor wordt echter sterk be\u00efnvloed door zijn abundantie, en deze kan bijvoorbeeld worden gereguleerd via transcriptie van het corresponderende gen. Transcriptieregulatie op zichzelf maakt echter geen snelle verlaging van eiwitniveaus mogelijk. Daarvoor zijn aanvullende regulatoire mechanismen noodzakelijk. Toenemend bewijs, waarvan een groot deel in dit proefschrift wordt gepresenteerd, suggereert dat ARF-prote\u00efnen zelf eveneens worden gereguleerd via proteasoom-gemedieerde afbraak. Hoe deze afbraak op moleculair niveau wordt gereguleerd, wat de biologische functies ervan zijn en hoe deze mechanismen zich evolutionair hebben ontwikkeld, zijn echter grotendeels onbeantwoorde vragen.\n\nIn dit proefschrift onderzoek ik de mechanismen, functies en de evolutionaire oorsprong van ARF-afbraak. Om deze vragen te beantwoorden maak ik gebruik van het levermos model Marchantia polymorpha. Marchantia bezit een minimaal, maar toch volledig, auxine signaleringsnetwerk en vormt daardoor een krachtig modelsysteem om fundamentele regulatoire mechanismen te bestuderen die in vaatplanten mogelijk verborgen blijven door genetische redundantie. Met een combinatie van genetische, biochemische en evolutionaire benaderingen toon ik in dit proefschrift aan dat afbraak van ARF transcriptiefactoren via het proteasoom een essentieel regulatiemechanisme vormt dat auxineresponsen vormgeeft.\n\nIn Hoofdstuk 1 introduceer ik auxine, haar rol in plantontwikkeling en het mechanisme van auxinesignalering. Dit hoofdstuk sluit af met een overzicht van de centrale thema\u2019s en onderzoeksvragen die in de daaropvolgende hoofdstukken worden behandeld. Hoofdstuk 2 biedt een conceptueel en historisch kader voor het proefschrift. Hierin bespreek ik de ontdekking van auxine en de chronologische ontrafeling van het Nuclear Auxin Pathway-model, met bijzondere aandacht voor de rol van het ubiquitine-proteasoomsysteem binnen auxinesignalering. Daarnaast bespreekt dit hoofdstuk aanwijzingen dat ARF-prote\u00efnen zelf mogelijk door afbraak worden gereguleerd en worden belangrijke openstaande vragen in het veld gedefinieerd en uiteengezet. In Hoofdstuk 3 ontwikkelen we experimentele hulpmiddelen om de dynamiek van auxinesignalering in vivo te bestuderen. Met behulp van homologe recombinatie worden fluorescent gelabelde knockin lijnen gegenereerd in Marchantia waarmee auxinesignaleringscomponenten vanuit hun endogene genomische loci kunnen worden gevisualiseerd. Deze experimenten leggen dynamische accumulatiepatronen van ARF-prote\u00efnen bloot en laten zien dat proteasoom-gemedieerde afbraak de stoichiometrie van ARF-prote\u00efnen tijdens de ontwikkeling snel kan veranderen. Deze observaties roepen nieuwe vragen op over de mechanismen die deze afbraak reguleren, die ik in de daaropvolgende hoofdstukken heb onderzocht. In Hoofdstuk 4 onderzoek ik de moleculaire basis van ARF-afbraak. Via analyses van eiwitsequenties identificeren we een geconserveerd motief in het DNA-bindingsdomein van ARF-prote\u00efnen dat fungeert als een afbraaksignaal. Functionele experimenten tonen aan dat dit motief noodzakelijk is voor ARF-afbraak en laten zien dat vergelijkbare mechanismen aanwezig zijn in diverse plantensoorten. Daarnaast laten we zien dat verstoring van dit afbraaksignaal de afbraak van ARF-prote\u00efnen belemmert, met ernstige gevolgen voor de ontwikkeling. In Hoofdstuk 5 onderzoek ik de ontwikkelingsbiologische gevolgen van verstoring van ARF-stabiliteit in meer detail. Door het genereren van induceerbare gestabiliseerde ARF-varianten, het complementeren van mutanten en een uitgebreide analyse van bijbehorende mutantfenotypes laat dit hoofdstuk zien dat gereguleerde ARF-afbraak essentieel is voor normale ontwikkeling en voor vrijwel alle levensstadia van Marchantia noodzakelijk is. Bovendien tonen de resultaten aan dat de A- en B-klasse ARF-prote\u00efnen verschillen in hun afhankelijkheid van proteolytische regulatie. In Hoofdstuk 6 en Hoofdstuk 7 richt ik me op het identificeren van componenten die betrokken zijn bij ARF-afbraak, waarbij verschillende maar complementaire strategie\u00ebn worden gebruikt. In Hoofdstuk 6 rapporteer ik een forward genetische screen in het mos Physcomitrium patens om regulators van ARF-afbraak te identificeren. Ik isoleer hier mutanten waarin de stabiliteit van ARF-prote\u00efnen verhoogd is, en breng de causale mutaties in kaart. Vervolgens identificeren we de genetische componenten die hiervoor mogelijk verantwoordelijk zijn. De experimenten die hier weer op volgen suggereren echter dat onze kandidaten waarschijnlijk geen directe rol spelen binnen het proces van ARF-afbraak. Hoofdstuk 7 maakt gebruik van TurboID-gebaseerde \u201cproximity labeling\u201d om eiwitten te identificeren die geassocieerd zijn met instabiele ARF-eiwitten. Deze benadering leverde een reeks kandidaat-interactiepartners op die mogelijk deel uitmaken van ARF-afbraakcomplexen. Deze genen bleken echter moeilijk te muteren, waardoor functionele analyse momenteel niet mogelijk is. Daarom worden alternatieve strategie\u00ebn voorgesteld om hun mogelijke rol in ARF-afbraak te testen. In Hoofdstuk 8 integreer ik de bevindingen van dit proefschrift, bespreekt hun biologische betekenis en plaatst ze in een bredere context van auxinebiologie, plantontwikkeling en evolutie. Daarnaast worden openstaande vragen uiteengezet en toekomstige onderzoekslijnen geschetst die gericht zijn op het identificeren van de moleculaire machinerie die verantwoordelijk is voor ARF-proteolyse.\n\nHet werk dat ik in dit proefschrift presenteer laat zien dat afbraak van ARF-transcriptiefactoren via het proteasoom een centraal regulatiemechanisme omvat in auxinesignalering en plantontwikkeling, met diepe evolutionaire wortels.","summary":"The transition from life in water to land represents one of the most profound evolutionary events in Earth\u2019s history. Around 600 million years ago, ancestors of present-day land plants colonized terrestrial habitats that were initially hostile and largely uninhabitable. Successful colonization of these environments required these early plants to evolve novel developmental mechanisms to cope with unprecedented environmental stressors. Meeting these challenges necessitated an increasingly complex multicellular body plan, which in turn required the development of sophisticated regulatory networks capable of coordinating growth, cellular patterning and responses to environmental cues.\n\nCentral to the regulation of plant development is the signaling molecule auxin, a phytohormone that governs a wide array of processes, including embryogenesis, organ formation, regeneration, and environmental adaptation. Auxin acts as a positional signal, guiding tissue patterning, cellular identity, and the timing of developmental events. Despite being a chemically simple molecule, auxin coordinates a vast diversity of developmental responses throughout the plant lifecycle. Understanding how auxin orchestrates these complex processes remains a central question in plant biology.\n\nAuxin signaling in land plants is primarily mediated through the Nuclear Auxin Pathway (NAP), a transcriptional molecular system that translates changes in intracellular auxin concentrations into specific changes in gene expression. Core components of the NAP are the AUXIN RESPONSE FACTOR (ARF) transcription factors, which bind to DNA elements and regulate the transcription of auxin-responsive genes. Their activity is modulated by Aux\/IAA inhibitor proteins, which repress ARF activity in the absence of auxin. When auxin levels increase, auxin promotes the interaction between Aux\/IAA proteins and the TIR1\/AFB receptor complex, leading to Aux\/IAA degradation through the 26S proteasome. Removal of these inhibitory proteins relieves the repression on ARF transcription factors, enabling transcriptional activation of auxin-responsive gene expression.\n\nWhile this canonical model provides a robust framework for understanding auxin signaling, it largely views ARF transcription factors as static components of the NAP, whose abundance is primarily determined by gene expression. However, emerging evidence, much of which is presented in this thesis, suggests that ARF proteins themselves are subject to regulated degradation through the 26S proteasome. How this degradation is regulated, its biological functions, and its evolutionary origins remain largely unexplored.\n\nIn this thesis, I investigate the mechanisms, functions, and evolutionary history of ARF degradation. To address these questions, I exploit the liverwort model Marchantia polymorpha, which possesses a minimal yet complete auxin signaling network. Using a combination of genetic, biochemical, and evolutionary approaches, I demonstrate that proteasome-mediated degradation of ARF transcription factors is an essential regulatory mechanism shaping auxin responses.\n\nIn Chapter 1 I introduce the signaling molecule auxin, its role in plant development, and the current understanding of the auxin signaling machinery. I conclude the chapter with an overview of the thesis and the specific research questions addressed in subsequent chapters. Chapter 2 provides a conceptual and historical framework for the thesis. It reviews the discovery of auxin and the chronological unraveling of the Nuclear Auxin Pathway model, with a focus on the role of the ubiquitin-proteasome system in auxin signaling. Furthermore, it discusses emerging evidence for ARF degradation and defines the key questions in the field. In Chapter 3 we develop experimental tools to study auxin signaling dynamics in vivo. By generating fluorescent genomic knockin lines in Marchantia, we visualize auxin signaling components from their native loci. This work reveals dynamic accumulation patterns of ARF proteins and demonstrates that proteasome-mediated degradation can rapidly alter ARF protein stoichiometry during development. These findings raise new questions about the mechanisms regulating ARF degradation, which I address in the following chapters. In Chapter 4 I investigate the molecular basis of ARF degradation. Through sequence analysis, we identify a conserved motif in the ARF DNA-binding domain that serves as a degradation signal. Functional assays demonstrate that this motif is necessary for ARF degradation and show that similar mechanisms are present across diverse plant species. Furthermore, I show that perturbing this signal leads to ARF stabilization, with severe developmental consequences. In Chapter 5 I explore the developmental consequences of perturbing ARF stability in greater detail. Through the generation of inducible stabilized ARF variants, mutant complementation assays, and a thorough analysis of concomitant mutant phenotypes, this chapter demonstrates that regulated ARF degradation is essential for normal development and is required throughout almost all Marchantia life stages. Additionally, the results presented in this chapter reveal functional differences between A- and B-class ARFs in their reliance on proteolytic regulation. In Chapter 6 and Chapter 7 I aim to identify components which regulate ARF degradation, using different, complementary strategies. In Chapter 6, I report on a forward genetic screen in the moss Physcomitrium patens to identify regulators of ARF degradation. I isolate mutants in which ARF stability is increased, and mapping the putative causative mutations lead to the identification of a set of candidate genetic components. Follow up experiments revealed that it is unlikely that any of these candidates are direct regulators of ARF degradation. Chapter 7 employs TurboID-based proximity labeling to identify proteins associated with unstable ARFs. This approach led to a selection of candidate interaction partners that may participate in ARF degradation complexes. These partners proved refractory to mutagenesis, preventing functional assessment at present. We provide alternative strategies to test their involvement in ARF degradation. In Chapter 8 I integrate the findings of the thesis, speculate on their biological roles, and discuss their broader implications for auxin biology, plant development, and evolutionary biology. The chapter highlights unresolved questions and outlines future research directions aimed at identifying the molecular machinery responsible for ARF proteolysis.\n\nThe work I presented in this thesis establishes proteasome-mediated degradation of ARF transcription factors as a central regulatory mechanism in auxin signaling and plant development, with deep evolutionary roots.","auteur":"Martijn de Roij","auteur_slug":"martijn-de-roij","publicatiedatum":"2 september 2026","taal":"EN","url_flipbook":"https:\/\/ebook.proefschriftmaken.nl\/ebook\/martijnderoij?iframe=true","url_download_pdf":"https:\/\/ebook.proefschriftmaken.nl\/download\/cebe71c6-8a3e-417e-bcd6-c38c9508b0f2\/optimized","url_epub":"","ordernummer":"19248","isbn":"978-94-6534-524-6","doi_nummer":"","naam_universiteit":"Wageningen University","afbeeldingen":16584,"naam_student:":"","binnenwerk":"","universiteit":"Wageningen University","cover":"","afwerking":"","cover_afwerking":"","design":""},"_links":{"self":[{"href":"https:\/\/www.proefschriftmaken.nl\/en\/wp-json\/wp\/v2\/us_portfolio\/16582","targetHints":{"allow":["GET"]}}],"collection":[{"href":"https:\/\/www.proefschriftmaken.nl\/en\/wp-json\/wp\/v2\/us_portfolio"}],"about":[{"href":"https:\/\/www.proefschriftmaken.nl\/en\/wp-json\/wp\/v2\/types\/us_portfolio"}],"author":[{"embeddable":true,"href":"https:\/\/www.proefschriftmaken.nl\/en\/wp-json\/wp\/v2\/users\/7"}],"replies":[{"embeddable":true,"href":"https:\/\/www.proefschriftmaken.nl\/en\/wp-json\/wp\/v2\/comments?post=16582"}],"version-history":[{"count":1,"href":"https:\/\/www.proefschriftmaken.nl\/en\/wp-json\/wp\/v2\/us_portfolio\/16582\/revisions"}],"predecessor-version":[{"id":16585,"href":"https:\/\/www.proefschriftmaken.nl\/en\/wp-json\/wp\/v2\/us_portfolio\/16582\/revisions\/16585"}],"wp:featuredmedia":[{"embeddable":true,"href":"https:\/\/www.proefschriftmaken.nl\/en\/wp-json\/wp\/v2\/media\/16583"}],"wp:attachment":[{"href":"https:\/\/www.proefschriftmaken.nl\/en\/wp-json\/wp\/v2\/media?parent=16582"}],"wp:term":[{"taxonomy":"us_portfolio_category","embeddable":true,"href":"https:\/\/www.proefschriftmaken.nl\/en\/wp-json\/wp\/v2\/us_portfolio_category?post=16582"}],"curies":[{"name":"wp","href":"https:\/\/api.w.org\/{rel}","templated":true}]}}