{"id":16473,"date":"2026-07-31T09:58:15","date_gmt":"2026-07-31T07:58:15","guid":{"rendered":"https:\/\/www.proefschriftmaken.nl\/portfolio\/vanessa-broker\/"},"modified":"2026-07-31T09:58:23","modified_gmt":"2026-07-31T07:58:23","slug":"vanessa-broker","status":"publish","type":"us_portfolio","link":"https:\/\/www.proefschriftmaken.nl\/en\/portfolio\/vanessa-broker\/","title":{"rendered":"Vanessa Broker"},"content":{"rendered":"","protected":true},"excerpt":{"rendered":"","protected":true},"author":7,"featured_media":16474,"comment_status":"closed","ping_status":"closed","template":"","meta":{"_acf_changed":false,"footnotes":""},"us_portfolio_category":[45],"class_list":["post-16473","us_portfolio","type-us_portfolio","status-publish","post-password-required","hentry","us_portfolio_category-new-template"],"acf":{"naam_van_het_proefschift":"Vascular Remodeling in Thrombo-Inflammation","samenvatting":"Hart- en vaatziekten (HVZ) vormen wereldwijd nog steeds de belangrijkste doodsoorzaak. Deze aandoeningen worden gekenmerkt door complexe interacties tussen vasculaire cellen, de extracellulaire matrix (ECM) en het hemostatische systeem. Trombo-inflammatie, een pathologisch proces waarbij stolling, ontsteking en de vaatwand elkaar be\u00efnvloeden, speelt een belangrijke rol bij vasculaire dysfunctie en draagt in belangrijke mate bij aan het ontstaan en de progressie van HVZ. De verschillende pijlers van trombo-inflammatie hebben nauwe interactie met elkaar, wat leidt tot verergering van trombose, vasculaire remodellering en vasculaire calcificatie. Ondanks aanzienlijke nieuwe inzichten in deze mechanismen bestaat er nog steeds een belangrijke kenniskloof.\n\nIn dit proefschrift hadden wij tot doel te onderzoeken hoe de ECM en het regulerende anticoagulante eiwit tissue factor pathway inhibitor (TFPI) bijdragen aan trombo-inflammatie en vasculaire pathologie. Dit proefschrift combineert literatuuroverzichten met experimentele studies om verbeterde in vitro modellen voor HVZ te ontwikkelen en nieuwe functies van TFPI in de vasculaire biologie te onderzoeken.\n\nIn Hoofdstuk 1 introduceren wij het concept van trombo-inflammatie en de relevantie hiervan voor HVZ. Het hoofdstuk beschrijft de interacties tussen coagulatie en ontsteking en hoe deze bijdragen aan vasculaire pathologie. Hierbij wordt bijzondere aandacht besteed aan de rol van vasculaire gladde spiercellen (VSMCs) en de ECM bij het behoudt van vasculaire integriteit en de regulatie van cellulair gedrag. Daarnaast wordt vasculaire calcificatie ge\u00efntroduceerd als een belangrijk pathologisch proces dat samenhangt met vasculaire remodellering en de progressie van HVZ. Verder wordt het anticoagulatie eiwit TFPI ge\u00efntroduceerd, inclusief de rol in de regulatie van tissue factor (TF)-gemedieerde stolling en de mogelijke betrokkenheid bij trombo-inflammatoire mechanismen. Het hoofdstuk behandelt tevens de samenstelling en betrokkenheid van arterieel ECM bij vaatziekten. Tot slot bespreken wij de huidige in vitro modellen die worden gebruikt voor onderzoek naar HVZ en belichten wij de beperkingen, met als doel deze kweekcondities te verbeteren om zo betrouwbare onderzoeksresultaten te verkrijgen. Het hoofdstuk sluit af met een overzicht van de opbouw van dit proefschrift.\n\nIn Hoofdstuk 2 presenteren wij een gepubliceerde literatuurstudie waarin de beperkingen van veelgebruikte in vitro modellen voor trombose worden besproken. Deze omvatten onder andere het veelvuldig gebruik van tweedimensionale kweekmodellen, het ontbreken van fysiologische stromingscondities en het gebruik van vereenvoudigde matrix substraten. De studie benadrukt de noodzaak van verbeterde experimentele systemen die de vasculaire micro-omgeving nauwkeuriger kunnen nabootsen. Bijzondere aandacht wordt besteed aan de keuze van de endotheelcel oorsprong, aangezien endotheelcellen (ECs) afkomstig uit verschillende weefsels of stamcellen uiteenlopende functionele eigenschappen vertonen. De voor- en nadelen van verschillende typen ECs worden daarom uitgebreid besproken. Daarnaast wordt in dit hoofdstuk onderzocht hoe trombose in vitro gemodelleerd kan worden, met speciale aandacht voor de interactie tussen bloedplaatjes en ECM eiwitten tijdens trombusvorming. Ook wordt de rol van hemodynamische krachten, met name wandschuifspanning, besproken in relatie tot mechanodetectie in ECs en de regulatie van EC functie. Ten slotte benadrukt het hoofdstuk het belang van het gebruik van fysiologisch relevante matrices in trombosemodellen.\n\nHoofdstuk 3 beschrijft de ontwikkeling van een nieuwe, natuurlijke ECM coating voor het verfijnen van in vitro HVZ modellen. Het hoofdstuk begint met een beschrijving van de beperkingen van veelgebruikte experimentele matrices, zoals collageen of Matrigel, die de complexiteit van een humane vasculaire ECM slechts gedeeltelijk weerspiegelen. Om deze beperkingen te ondervangen hebben wij een humane arteri\u00eble matrix (hAM) ontwikkeld door middel van een decellularisatie- en solubilisatieproces vanuit arterieel weefsel van de navelstreng. De resulterende matrix werd gekarakteriseerd met behulp van vloeistofchromatografie-massaspectrometrie. Hieruit bleek dat hAM een verscheidenheid aan vasculaire en ECM eiwitten bevatte die niet aanwezig zijn in Matrigel. Functionele studies toonden aan dat VSMCs die op hAM werden gekweekt een meer contractiel en fysiologisch relevanter fenotype vertoonden, wat duidt op een gezondere VSMC-toestand. Daarnaast be\u00efnvloedde de matrix de diameter van vaten in een driedimensionaal model voor vascularisatie. Ook had de matrix invloed op trombosegerelateerde processen, waaronder bloedplaatjesactivatie, bloedplaatjesaggregatie en trombusvorming onder stromingscondities, die verschilden van de reacties die werden waargenomen onder condities met alleen collageen. De aanwezigheid van TF in de matrix maakte bovendien een fysiologisch relevante activatie van de stollingscascade mogelijk. Deze bevindingen tonen aan dat de hAM matrix een waardevol hulpmiddel kan vormen voor het bestuderen van trombose in vitro.\n\nIn Hoofdstuk 4 bespreken wij de veelzijdige rol van TFPI bij arteri\u00eble trombo-inflammatie. Het concept van trombo-inflammatie wordt verder uitgewerkt door een nieuw conceptueel kader voor te stellen waarin het proces wordt onderverdeeld in drie onderling verbonden pijlers: ontsteking, stolling, en de vaatwand. Het hoofdstuk geeft een gedetailleerd overzicht van de structuur en biologische functie van TFPI, inclusief de remmende werking op het TF\/FVIIa\/FXa complex. Daarnaast hebben wij gegevens uit meer dan vijftig klinische studies verzameld en geanalyseerd om geactualiseerde plasmaconcentraties van verschillende TFPI-vormen vast te stellen, waaronder totaal TFPI, vrij TFPI, volledig TFPI, en ingekorte varianten. Tot slot bespreken wij de verschillende rollen van TFPI binnen trombo-inflammatoire processen door zijn betrokkenheid bij elk van de drie pijlers te analyseren, met bijzondere aandacht voor de rol bij vasculaire aandoeningen en bij ziekten zoals het antifosfolipidensyndroom.\n\nHoofdstuk 5 richt zich op de functionele karakterisatie van een nieuwe gedeeltelijk functionele TFPI-variant die defici\u00ebnt is in het tweede Kunitz-domein. Met behulp van CRISPR-gemedieerde genome editing hebben wij het tweede Kunitz-domein van TFPI gemuteerd in ge\u00efnduceerde pluripotente stamcellen (iPSCs). Deze gemodificeerde iPSCs werden vervolgens gedifferentieerd tot ECs om de functionele gevolgen van deze mutatie te bestuderen. Moleculaire dynamica simulaties werden uitgevoerd om de interactie tussen het gemuteerde TFPI eiwit en factor Xa te evalueren, waaruit een verminderde binding bleek. Experimentele analyses toonden aan dat het gemuteerde TFPI eiwit nog steeds in staat was factor FVIIa en het protrombinase-complex te remmen, maar factor Xa niet meer effectief kon inhiberen. Als gevolg hiervan vertoonde het geconditioneerde medium van deze EC een verhoogde trombinevorming.\n\nIn Hoofdstuk 6 hebben wij de rol van deze gemuteerde TFPI-variant verder onderzocht in VSMCs, waarbij wij specifiek hebben gekeken naar de regulatie van het VSMC-fenotype en de vasculaire remodellering. De eerder beschreven iPSCs werden gedifferentieerd tot VSMCs en onderworpen aan transcriptomische analyse. RNA-sequencing liet een differenti\u00eble regulatie zien van genen die betrokken zijn bij ECM-organisatie en celproliferatie. TFPI-mutante VSMCs vertoonden een verhoogde proliferatie en een opregulatie van ribosomale genen, gecombineerd met een downregulatie van het p53-signaleringsnetwerk. Morfologische analyses toonden aan dat de mutante cellen kleiner en ronder waren en een verminderde expressie van contractiele markers vertoonden. Deze bevindingen wijzen op een verschuiving naar een synthetisch VSMC-fenotype. Daarnaast produceerden TFPI-mutante cellen meer extracellulaire blaasjes (EV) en vertoonden zij een verhoogde calcificatie onder pro-calcificerende omstandigheden. Belangrijk is dat deze calcificatie gedeeltelijk kon worden geremd door behandeling met recombinant TFPI. Verdere analyses toonden verschillen aan in signaleringsroutes die betrokken zijn bij ECM-remodellering, osteogene differentiatie en regulatie van EVs. Deze processen hebben een belangrijke rol spelen bij vasculaire calcificatie. Bovendien vertoonden VSMCs zonder functioneel TFPI een verhoogde trombinevorming, wat geassocieerd was met een hogere expressie van TF in de mutante cellen.\n\nIn Hoofdstuk 7 geven wij een algemene discussie waarin de bevindingen van dit proefschrift worden ge\u00efntegreerd en geplaats in de context van de huidige wetenschappelijke kennis. Het hoofdstuk benadrukt het belang van het in beschouwing nemen van de ECM en de interacties tussen vasculaire cellen bij het bestuderen van trombo-inflammatoire processen. Daarnaast worden de sterke punten en beperkingen van de studies in dit proefschrift besproken en worden aanbevelingen gedaan voor toekomstig onderzoek.\n\nTot slot bespreken wij in Hoofdstuk 8 de maatschappelijke en klinische implicaties van dit onderzoek. Op korte termijn kan een beter begrip van de biologie van TFPI en van plasmaconcentraties van TFPI bijdragen aan verbeterde diagnostische benaderingen en therapeutische strategie\u00ebn. Ook kan de ontwikkeling van verbeterde in vitro modellen met een natuurlijke vasculaire ECM bijdragen aan een grotere fysiologische relevantie van cardiovasculair onderzoek. Op middellange en op lange termijn suggereert de identificatie van TFPI als regulator van vasculaire remodellering, VSMC-fenotype, en vasculaire calcificatie dat dit eiwit een potentieel therapeutisch doelwit vormt voor HVZ, wat mogelijk kan bijdragen aan een vermindering van HVZ-gerelateerde morbiditeit en mortaliteit.","summary":"Cardiovascular disease (CVD) remains the leading cause of mortality worldwide. It is driven by complex interactions between vascular cells, the extracellular matrix (ECM), and the hemostatic system. Thrombo-inflammation, a pathological process in which coagulation, inflammation and the vessel wall intersect, drives vascular dysfunction and significantly contributes to the burden of CVD development and progression. Within this framework, the different pillars of thrombo-inflammation interact tightly to aggravate thrombosis, vascular remodeling, and vascular calcification. Despite significant advancements in understanding these mechanisms, there are still large knowledge gaps present.\n\nIn this thesis, we aimed to investigate how the ECM and the regulatory anticoagulant tissue factor pathway inhibitor (TFPI) contribute to thrombo-inflammation and vascular pathology. It combines literature reviews with experimental studies to develop improved in vitro models of CVD and to investigate novel functions of TFPI in vascular biology.\n\nIn Chapter 1, we introduce the concept of thrombo-inflammation and its relevance to CVD. It outlines the interactions between coagulation, inflammation, and how it drives vascular pathology. Particular attention is given to the role of vascular smooth muscle cells (VSMCs) and the ECM in maintaining vascular integrity and regulating cellular behavior. The chapter also introduced vascular calcification as a key pathological process associated with vascular remodeling and CVD progression. Further, the anticoagulant protein TFPI is introduced, including its role in regulating tissue factor (TF)-mediated coagulation and its involvement in thrombo-inflammatory mechanisms. The chapter also discusses the composition of the arterial ECM and its involvement in vascular diseases. Finally, we review current in vitro models used to study CVD, highlighting their limitations in order to focus on improving culture conditions for more reliant research results. The chapter concludes with an outline of this thesis.\n\nIn Chapter 2, we present a published review discussing the aforementioned limitations of commonly used in vitro models of thrombosis, including the widespread use of two-dimensional cultures, the absence of physiological flow conditions, and the use of simplified matrix substrates. The review highlights the need for improved experimental systems that more accurately recapitulate the vascular microenvironment. Particular attention is given to the selection of endothelial cell (EC) sources, as ECs derived from different tissues or stem cells exhibit distinct functional properties. The advantages and limitations of various EC types are therefore discussed. Additionally, the chapter examines how thrombosis can be modeled in vitro, with a focus on the interaction between platelets and ECM proteins during thrombosis formation. The role of hemodynamic forces, particularly shear stress, is also discussed in relation to endothelial mechanosensing and regulation of EC function. Finally, the chapter emphasizes the importance of incorporating physiologically relevant matrices in thrombosis models.\n\nChapter 3 describes the development of a novel native ECM coating for refining in vitro models of CVD. The chapter begins by outlining the limitations of commonly used experimental matrices such as collagen or Matrigel, which do not fully represent the complexity of a human vascular ECM. To address these limitations, we derived a human arterial matrix (hAM) from umbilical cord artery tissue through a decellularization and solubilization process. The resulting matrix was characterized using liquid chromatography-mass spectrometry and revealed to have a variety of vascular and ECM proteins that were shown to be absent in Matrigel. Functional studies demonstrated that culturing VSMCs on hAM promoted a more contractile and physiologically relevant phenotype, indicative of healthier VSMCs. In addition, the matrix showed to influence the diameter of vessels in a three-dimensional model of vascularization. It also influenced thrombosis-related processes, including platelet activation, platelet aggregation, and thrombus formation under flow conditions, which differed from responses observed under collagen-only conditions. The presence of TF within the matrix further enables physiologically relevant coagulation activation, demonstrating that this matrix may serve as a valuable tool for studying thrombosis in vitro.\n\nIn Chapter 4, we review the multifaceted roles of TFPI in arterial thrombo-inflammation. The concept of thrombo-inflammation is further explored by proposing a novel framework that divides the process into three interconnected pillars, namely inflammation, coagulation, and the vessel wall. The chapter provides a detailed overview of the structure and biological function of TFPI, including its inhibitory effects on the TF\/FVIIa\/FXa complex. In addition, we compile and analyze data from more than 50 clinical studies to determine updated plasma concentrations of different TFPI forms, including total TFPI, free TFPI, full-length TFPI, and truncated variants. Finally, we dive into the different roles of TFPI in thrombo-inflammatory processes by examining its involvement in each of the three pillars, with particular attention given to its role in vascular disease and conditions such as antiphospholipid syndrome.\n\nChapter 5 focuses on the structural and functional characterization of a novel partially functional TFPI variant deficient in Kunitz domain 2. Using CRISPR-mediated genome editing, we mutated the Kunitz domain 2 region of TFPI in induced pluripotent stem cells (iPSCs). These modified iPSCs were subsequently differentiated into ECs to study the functional consequence of the mutation. Molecular dynamics simulations were performed to evaluate the interaction between the mutated TFPI protein and FXa, revealing impaired binding. Experimental analyses showed that the mutant TFPI protein retained the ability to inhibit factor VIIa and the prothrombinase complex but was unable to effectively inhibit FXa. As a consequence, conditioned medium from those ECs exhibited increased thrombin generation.\n\nWe further investigated the role of this mutated TFPI variant in VSMCs in Chapter 6, where we looked into the role of TFPI in regulating VSMC phenotype and vascular remodeling. The aforementioned iPSCs were differentiated into VSMCs and subjected to transcriptomic analysis. RNA sequencing revealed differential regulation of genes involved in ECM organization and cellular proliferation. TFPI mutant VSMCs showed increased proliferation and upregulation of ribosomal genes, accompanied by downregulation of the p53 signaling network. Morphological analyses demonstrated that mutant cells were smaller and rounder, and they exhibited reduced expression of contractile markers. These finding indicate a shift toward a synthetic VSMC phenotype. In addition, TFPI mutant cells released more extracellular vesicles and displayed enhanced calcification under pro-calcific conditions. Importantly, calcification could be partially reduced by treatment with recombinant TFPI. Further analyses revealed differential signaling in pathways related to ECM remodeling, osteogenic differentiation, and vesicle regulation, which are particularly important for vascular calcification. Moreover, VSMCs lacking functional TFPI showed increased thrombin formation, which was associated with higher TF expression in mutant cells.\n\nIn Chapter 7, we provide a general discussion that integrates our findings from this thesis and places them in context with current scientific knowledge. The chapter highlights the importance of considering ECM composition and vascular cell interactions with studying thrombo-inflammatory processes. It also discusses the strength and limitations of the studies presented in this thesis and identifies directions for future research.\n\nFinally, in Chapter 8, we address the societal and economical implications of this work. In the short term, the updated understanding of TFPI biology and plasma levels may contribute to improved diagnostic approached and therapeutic strategies. Also, the development of improved in vitro models incorporating a native vascular ECM may enhance the physiological relevance of cardiovascular research. In the medium and long term, the identification of TFPI as a regulator of vascular remodeling, VSMC phenotype, and calcification, highlights its potential as a therapeutic target for CVD that potentially contributes to the decrease of CVD-related morbidities and mortalities.","auteur":"Vanessa Broker","auteur_slug":"vanessa-broker","publicatiedatum":"7 september 2026","taal":"EN","url_flipbook":"https:\/\/ebook.proefschriftmaken.nl\/ebook\/vanessabroker?iframe=true","url_download_pdf":"https:\/\/ebook.proefschriftmaken.nl\/download\/5de87e01-3a60-49ea-a5ee-783b8f459d7f\/optimized","url_epub":"","ordernummer":"19295","isbn":"","doi_nummer":"","naam_universiteit":"Universiteit Maastricht","afbeeldingen":16475,"naam_student:":"","binnenwerk":"","universiteit":"Universiteit Maastricht","cover":"","afwerking":"","cover_afwerking":"","design":""},"_links":{"self":[{"href":"https:\/\/www.proefschriftmaken.nl\/en\/wp-json\/wp\/v2\/us_portfolio\/16473","targetHints":{"allow":["GET"]}}],"collection":[{"href":"https:\/\/www.proefschriftmaken.nl\/en\/wp-json\/wp\/v2\/us_portfolio"}],"about":[{"href":"https:\/\/www.proefschriftmaken.nl\/en\/wp-json\/wp\/v2\/types\/us_portfolio"}],"author":[{"embeddable":true,"href":"https:\/\/www.proefschriftmaken.nl\/en\/wp-json\/wp\/v2\/users\/7"}],"replies":[{"embeddable":true,"href":"https:\/\/www.proefschriftmaken.nl\/en\/wp-json\/wp\/v2\/comments?post=16473"}],"version-history":[{"count":1,"href":"https:\/\/www.proefschriftmaken.nl\/en\/wp-json\/wp\/v2\/us_portfolio\/16473\/revisions"}],"predecessor-version":[{"id":16476,"href":"https:\/\/www.proefschriftmaken.nl\/en\/wp-json\/wp\/v2\/us_portfolio\/16473\/revisions\/16476"}],"wp:featuredmedia":[{"embeddable":true,"href":"https:\/\/www.proefschriftmaken.nl\/en\/wp-json\/wp\/v2\/media\/16474"}],"wp:attachment":[{"href":"https:\/\/www.proefschriftmaken.nl\/en\/wp-json\/wp\/v2\/media?parent=16473"}],"wp:term":[{"taxonomy":"us_portfolio_category","embeddable":true,"href":"https:\/\/www.proefschriftmaken.nl\/en\/wp-json\/wp\/v2\/us_portfolio_category?post=16473"}],"curies":[{"name":"wp","href":"https:\/\/api.w.org\/{rel}","templated":true}]}}