{"id":15449,"date":"2026-05-26T08:00:39","date_gmt":"2026-05-26T08:00:39","guid":{"rendered":"https:\/\/www.proefschriftmaken.nl\/portfolio\/chen-yang\/"},"modified":"2026-05-26T08:01:02","modified_gmt":"2026-05-26T08:01:02","slug":"chen-yang","status":"publish","type":"us_portfolio","link":"https:\/\/www.proefschriftmaken.nl\/en\/portfolio\/chen-yang\/","title":{"rendered":"Chen Yang"},"content":{"rendered":"","protected":true},"excerpt":{"rendered":"","protected":true},"author":7,"featured_media":15450,"comment_status":"closed","ping_status":"closed","template":"","meta":{"_acf_changed":false,"footnotes":""},"us_portfolio_category":[45],"class_list":["post-15449","us_portfolio","type-us_portfolio","status-publish","post-password-required","hentry","us_portfolio_category-new-template"],"acf":{"naam_van_het_proefschift":"Structure-Function Relationship of Bacterial Glycogen Branching Enzymes","samenvatting":"Glycogeen is een vertakt glucose polymeer dat door allerlei organismen aangemaakt wordt als korte of lange termijn energieopslag. Bij zoogdieren zoals de koe, de hond en de mens wordt glycogeen voornamelijk in spieren opgeslagen als korte termijn energieopslag. Zetmeel en suiker wordt in de dunne darm ongezet naar glucose en het teveel aan glucose wordt vervolgens omgezet in glycogeen. In veel micro-organismen zoals de rode microalgen en allerlei bacteri\u00ebn wordt glycogeen opgeslagen voor tijden dat er weinig tot geen geschikte koolstof- en energiebron voorhanden is. Glycogeen is een concentrisch compact molecuul opgebouwd uit anhydroglucopyranose eenheden die aan elkaar gekoppeld zijn via voornamelijk alpha-1,4-O-glycoidische bindingen met af en toe een alpha-1,6-O-glycosidische binding; deze laatste bindingen worden ook wel een vertakking genoemd. Deze vertakkingen worden gesynthetiseerd door glycogeen vertakkingsenzymen. Deze enzymen zijn ook commercieel interessant omdat ze gebruikt kunnen worden om de physisch-chemische eigenschappen van opgelost zetmeel te veranderen en zo een kleefstof of een langzaam afbreekbaar zetmeel te maken.\n\nDe meeste glycogeen vertakkingsenzymen behoren tot glycoside hydrolase familie 13 (GH13), welke verder onderverdeeld wordt in subfamilie GH13_8 en GH13_9. Daarnaast zijn er een redelijk aantal glycogeen vertakkingsenzymen welke tot de familie 57 van de glycoside hydrolases behoren. De subfamilie GH13_9 is uitgebreid bestudeerd, terwijl er aanzienlijk minder bekend is over glycogeen vertakkingsenzymen van subfamilie GH13_8. Tot nu werd verondersteld dat GH13_8-glcyogeen vertakkingsenzymen dezelfde structuur en werking hebben als GH13_9-enzymen. Een recente studie naar een GH13_8-glycogeen vertakkingsenzym uit Oryza sativa (rijst) liet echter zien dat dit enzym een specifieke bindingsplaats heeft voor kortere malto-oligosacharide zoals een met 12 anhydroglucopyranose. Eenheden. Deze bindingsplaats is afwezig in GH13_9. Dit is mede de aanleiding geweest om glycogeen vertakkingsenzymen van de subfamilie GH13_8 nader te bestuderen. De resultaten van deze studie zijn in dit proefschrift beschreven. Zo werden enkele factoren die bepalend kunnen zijn voor de lengte van de vertakte zijketens ge\u00efdentificeerd. Daarnaast werd een voorheen onbekende bindingsroute voor het acceptorsubstraat ge\u00efdentificeerd, en werd de rol van het unieke N-terminale domein in GH13_8-GBEs verder verduidelijkt. Tenslotte werden enkele strategie\u00ebn voor optimalisatie van de enzymatische werking in meer detail onderzocht.\n\nIn hoofdstuk 2 worden studies die zich richten op de karakterisering van het GH13_8 glycogeen vertakkingsenzym van de bacterie Anaerococcus prevotii (ApGBE13_8) beschreven en wordt dit enzym vergeleken met een GH13_9 glycogeen vertakkingsenzym uit diezelfde bacteriesoort (ApGBE13_9). Deze studie levert het eerste bewijs dat een prokaryotisch, bacterieel GH13_8-glycogeen vertakkingsenzym in staat is \u03b1,1-6-O-glycosidische bindingen te vormen. In tegenstelling tot GH13_9 glycogeen vertakkingsenzymen werkt ApGBE13_8 op korte malto-oligosachariden vari\u00ebrend van maltotriose (Mal3) tot maltoheptaose (Mal7), waarbij zeer korte vertakkingen met een ketenlengte van 2 tot 4 eenheden worden gevormd op maltooctadecaose (Mal18). Op basis van een door AlphaFold voorspelde structuur worden twee lussen (nabij aminozuurresiduen 131 en 509) in ApGBE13_8 verondersteld verantwoordelijk te zijn voor de voorkeur voor korte vertakte ketens. Deze lussen kunnen het verlengingspad van de vertakkingsketen gedeeltelijk blokkeren en zo de lengte van de vertakte keten be\u00efnvloeden. Daarnaast bleek ApGBE13_8 specifieke O-glycosidische bindingen te splitsen afhankelijk van de substraatlengte: het resterende donorsubstraat heeft een ketenlengte van slechts 1 tot 2 anhydroglycopyranose eenheden bij substraten korter dan Mal7, en een ketenlengte van 2 tot 4 bij Mal18. Dit gedrag wordt eveneens in verband gebracht met lussen 131 en 509, die zich mogelijk dynamisch aanpassen aan de donorstructuur en zo de lengte van de vertakte keten en splitsingsspecificiteit be\u00efnvloeden.\n\nIn Hoofdstuk 3 wordt een studie beschreven naar de structurele factoren die de lengte van de vertakte ketens gemaakt door glycogeen vertakkingsenzymen bepalen. Daarin wordt nadrukkelijk gekeken naar drie aminozuur lussen (104, 185 en 454) nabij de vertakkingsgroeve van ApGBE13_9. Hoewel alle drie lussen voorkomen in zowel GH13_8- als GH13_9-glycogeen vertakkingsenzymen, bevatten lussen 104 en 454 consistent meer aminozuren in GH13_8 glycogeen vertakkingsenzymen. De verschillende productprofielen die in hoofdstuk 2 werden waargenomen, suggereren dat deze variaties van invloed zijn op de vertakkingslengte. Door middel van lus-substitutie-experimenten werden de langere aminozuur lussen 104 en 454 van ApGBE13_8 ge\u00efntroduceerd in ApGBE13_9. Vervanging van uitsluitend lus 454 leidde tot een ApGBE13_8-achtig activiteitspatroon met korte vertakkingen van 3 tot 4 eenheden op maltononadecaose (Mal19), terwijl dubbele substitutie van lussen 104 en 454 resulteerde in een bredere vertakkingslengtespecificiteit drie tot acht eenheden. Moleculaire-dynamica simulaties toonden aan dat introductie van de lange lus 454 de flexibiliteit verhoogt en lus 185 verstoort, wat leidt tot een geblokkeerde conformatie die belemmert verlenging van de vertakkingsketen en korte vertakkingen bevordert. Wanneer beide lussen werden gesubstitueerd, functioneerden zij als een dynamische \u201cdeur\u201d die zowel korte als lange vertakkingen mogelijk maakt. Vervanging van de lange lus 454 in ApGBE13_8 door de korte lus uit ApGBE13_9 resulteerde in volledig verlies van vertakkingsactiviteit, wat aantoont dat lus 454 essentieel is voor zowel vertakkingslengte als vertakkingsactiviteit.\n\nHoofdstuk 4 richt zich op de acceptor bindingsgroeve van GH13_8-glycogeen vertakkingsenzymen, met het GH13_8-enzym uit de bacterie Clostridioides difficile als modelsysteem. Analyse van de aminozuurvolgorde van alle glycogeen vertakkingsenzymen van deze subfamilie bracht een regio aan het licht die in al deze enzymen zowel de vertakkingsgroeve als de substraat toegangsgroeve kruist ter hoogte van de drie katalytische aminozuren, wat resulteert in een Y-vormige structuur. Substitutie analyse van geconserveerde residuen binnen deze groeve leidden in vrijwel alle gevallen tot een sterke afname van enzymatische activiteit. Na incubatie met maltoheptaose of maltodecanonaose verloren de mutanten vrijwel volledig hun vertakkingsactiviteit en behielden zij uitsluitend hydrolytische en transglycosylerende activiteiten. Moleculaire-dynamica simulaties toonden aan dat sleutel residuen bijdragen aan substraatbinding via waterstofbruggen (K460, D468 en E518) en van-der-Waalsinteracties (F464 en W519). Deze resultaten komen overeen met recente bevindingen voor O. sativa BEI en bevestigen dat deze acceptorbindingsgroeve specifiek is voor GH13_8-enzymen. Rationele engineering van deze groeve resulteerde in mutanten met verhoogde katalytische activiteit.\n\nHoofdstuk 5 richtte zich op de ingang van GH13_8 glycogeen vertakkingsenzymen. De terminale helices van het N-terminale domein en twee omliggende lussen vormen samen ingang van het enzym. Mutatie- en truncatie-experimenten toonden aan dat deze regio\u2019s de binding van korte malto-oligosachariden en de afgifte van het gesplitste donorfragment faciliteren. Moleculaire-dynamica simulaties identificeerden residuen K8, K397 en K444 als cruciaal voor substraatbinding. Mutaties nabij deze residuen, zoals I396T en G442S, leidden tot een significante verhoging van de enzymatische activiteit.\n\nDit proefschrift verdiept het inzicht in werking van glycogeen vertakkingsenzymen van subfamilie GH13_8. Er zijn aanwijzingen gevonden dat specifieke structurele elementen zoals aminozuur lussen, de acceptorbindingsgroeve en de ingang, de enzymatische activiteit en het productprofiel bepalen. De succesvolle verbetering van enzymatische activiteit via rationele eiwit engineering onderstreept het potentieel van GH13_8-GBEs als biokatalysatoren voor de gerichte synthese van \u03b1-glucanen. Deze bevindingen vormen een goede basis voor toekomstig onderzoek naar structuur-functierelaties en openen nieuwe perspectieven voor toepassingen in zetmeelmodificatie en functioneel koolhydraatontwerp.","summary":"Glycogen is a branched glucose polymer produced by various organisms as short- or long-term energy storage. In mammals such as cows, dogs, and humans, glycogen is primarily stored in muscles as short-term energy reserve. Starch and sugar are converted to glucose in the small intestine, and excess glucose is subsequently converted into glycogen. In many microorganisms, such as red microalgae and various bacteria, glycogen is stored for times when suitable carbon and energy sources are scarce. Glycogen is a concentric, compact molecule composed of anhydroglucopyranose units linked primarily via alpha-1,4-O-glycosidic bonds, with occasional alpha-1,6-O-glycosidic bonds, also known as branches. These branches are synthesized by glycogen branching enzymes (GBEs). These enzymes are also commercially interesting because they can be used to alter the physico-chemical properties of dissolved starch to create adhesives or slowly degradable starch.\n\nMost glycogen branching enzymes belong to glycoside hydrolase family 13 (GH13), which is further subdivided into subfamilies GH13_8 and GH13_9. Additionally, a significant number of GBEs belong to GH family 57. Subfamily GH13_9 has been extensively studied, while considerably less is known about GBEs in subfamily GH13_8. Until now, it was assumed that GH13_8 GBEs shared the same structure and function as GH13_9 enzymes. However, a recent study on a GH13_8 GBE from Oryza sativa (rice) revealed that this enzyme possesses a specific binding site for shorter malto-oligosaccharides, such as those with 12 units, which is absent in GH13_9. This discovery prompted a more detailed study of GH13_8 GBEs. The results of this study are described in this thesis. Factors determining branch chain length were identified, a previously unknown acceptor substrate binding pathway was characterized, and the role of the unique N-terminal domain in GH13_8 GBEs was further clarified. Finally, strategies for optimizing enzymatic activity were investigated in detail.\n\nChapter 2 describes the characterization of the GH13_8 GBE from the bacterium Anaerococcus prevotii (ApGBE13_8) and compares it with a GH13_9 GBE from the same species (ApGBE13_9). This study provide the first evidence that a prokaryotic, bacterial GH13_8 GBE is capable of forming \u03b1,1-6-O-glycosidic bonds. In contrast to GH13_9 GBEs, ApGBE13_8 acts on short malto-oligosaccharides ranging from maltotriose (Mal3) to maltoheptaose (Mal7), forming very short branches of 2 to 4 units on maltooctadecaose (Mal18). Based on an AlphaFold-predicted structure, two loops (near residues 131 and 509) in ApGBE13_8 are hypothesized to be responsible for the preference for short branches by partially blocking the extension path of the branch chain. Additionally, ApGBE13_8 was found to cleave specific O-glycosidic bonds depending on substrate length: the remaining donor substrate has a length of only 1 to 2 units for substrates shorter than Mal7, and 2 to 4 units for Mal18. This behavior is linked to loops 131 and 509, which may dynamically adapt to the donor structure.\n\nChapter 3 investigates the structural factors determining branch chain length. Specifically, three amino acid loops (104, 185, and 454) near the branching groove of ApGBE13_9 were examined. Although all three loops are present in both GH13_8 and GH13_9 GBEs, loops 104 and 454 consistently contain more amino acids in GH13_8 enzymes. Loop substitution experiments introduced the longer loops from ApGBE13_8 into ApGBE13_9. Replacing loop 454 alone led to an ApGBE13_8-like activity pattern with short branches (DP3-4), while double substitution of loops 104 and 454 resulted in a broader specificity (DP3-8). Molecular dynamics simulations showed that the long loop 454 increases flexibility and disrupts loop 185, leading to a blocked conformation that hinders branch extension. When both loops were substituted, they functioned as a dynamic 'door' allowing both short and long branches. Replacing the long loop 454 in ApGBE13_8 with the short loop from ApGBE13_9 resulted in total loss of branching activity, proving that loop 454 is essential for both length and activity.\n\nChapter 4 focuses on the acceptor binding groove of GH13_8 GBEs, using the enzyme from Clostridioides difficile as a model. Sequence analysis revealed a region crossing both the branching and entry grooves at the catalytic site, forming a Y-shaped structure. Substitution of conserved residues within this groove significantly decreased activity. Mutants almost completely lost branching activity while retaining hydrolytic and transglycosylation functions. Simulations showed that key residues contribute to binding via hydrogen bonds (K460, D468, E518) and van der Waals interactions (F464, W519). These results confirm that this groove is specific to GH13_8. Rational engineering produced mutants with enhanced catalytic activity.\n\nChapter 5 addresses the substrate entrance of GH13_8 GBEs. Terminal helices of the N-terminal domain and two surrounding loops form the entrance. Mutations and truncations showed these regions facilitate the binding of short oligosaccharides and the release of cleaved donor fragments. Key residues (K8, K397, K444) were identified as crucial for binding. Mutations such as I396T and G442S significantly increased enzymatic activity.\n\nThis thesis deepens the understanding of GH13_8 subfamily glycogen branching enzymes. Specific structural elements like loops, the acceptor binding groove, and the entrance were found to determine activity and product profiles. Successful enhancement of activity via rational engineering highlights the potential of GH13_8 GBEs as biocatalysts for targeted alpha-glucan synthesis, providing a basis for future research and applications in starch modification and functional carbohydrate design.","auteur":"Chen Yang","auteur_slug":"chen-yang","publicatiedatum":"29 juni 2026","taal":"NL","url_flipbook":"https:\/\/ebook.proefschriftmaken.nl\/ebook\/chenyang?iframe=true","url_download_pdf":"https:\/\/ebook.proefschriftmaken.nl\/download\/7cab5a03-f67e-42ea-a436-d8db46297662\/optimized","url_epub":"","ordernummer":"19112","isbn":"","doi_nummer":"","naam_universiteit":"Rijksuniversiteit Groningen","afbeeldingen":15451,"naam_student:":"","binnenwerk":"","universiteit":"Rijksuniversiteit Groningen","cover":"","afwerking":"","cover_afwerking":"","design":""},"_links":{"self":[{"href":"https:\/\/www.proefschriftmaken.nl\/en\/wp-json\/wp\/v2\/us_portfolio\/15449","targetHints":{"allow":["GET"]}}],"collection":[{"href":"https:\/\/www.proefschriftmaken.nl\/en\/wp-json\/wp\/v2\/us_portfolio"}],"about":[{"href":"https:\/\/www.proefschriftmaken.nl\/en\/wp-json\/wp\/v2\/types\/us_portfolio"}],"author":[{"embeddable":true,"href":"https:\/\/www.proefschriftmaken.nl\/en\/wp-json\/wp\/v2\/users\/7"}],"replies":[{"embeddable":true,"href":"https:\/\/www.proefschriftmaken.nl\/en\/wp-json\/wp\/v2\/comments?post=15449"}],"version-history":[{"count":1,"href":"https:\/\/www.proefschriftmaken.nl\/en\/wp-json\/wp\/v2\/us_portfolio\/15449\/revisions"}],"predecessor-version":[{"id":15452,"href":"https:\/\/www.proefschriftmaken.nl\/en\/wp-json\/wp\/v2\/us_portfolio\/15449\/revisions\/15452"}],"wp:featuredmedia":[{"embeddable":true,"href":"https:\/\/www.proefschriftmaken.nl\/en\/wp-json\/wp\/v2\/media\/15450"}],"wp:attachment":[{"href":"https:\/\/www.proefschriftmaken.nl\/en\/wp-json\/wp\/v2\/media?parent=15449"}],"wp:term":[{"taxonomy":"us_portfolio_category","embeddable":true,"href":"https:\/\/www.proefschriftmaken.nl\/en\/wp-json\/wp\/v2\/us_portfolio_category?post=15449"}],"curies":[{"name":"wp","href":"https:\/\/api.w.org\/{rel}","templated":true}]}}