{"id":14610,"date":"2026-04-30T11:25:48","date_gmt":"2026-04-30T11:25:48","guid":{"rendered":"https:\/\/www.proefschriftmaken.nl\/portfolio\/ton-winkelmolen\/"},"modified":"2026-04-30T11:26:06","modified_gmt":"2026-04-30T11:26:06","slug":"ton-winkelmolen","status":"publish","type":"us_portfolio","link":"https:\/\/www.proefschriftmaken.nl\/en\/portfolio\/ton-winkelmolen\/","title":{"rendered":"Ton Winkelmolen"},"content":{"rendered":"","protected":true},"excerpt":{"rendered":"","protected":true},"author":7,"featured_media":14611,"comment_status":"closed","ping_status":"closed","template":"","meta":{"_acf_changed":false,"footnotes":""},"us_portfolio_category":[45],"class_list":["post-14610","us_portfolio","type-us_portfolio","status-publish","post-password-required","hentry","us_portfolio_category-new-template"],"acf":{"naam_van_het_proefschift":"Molecular insights into the role of VRS5 in tillering and lateral spikelet development in barley","samenvatting":"Hoe een plant eruit ziet, oftewel plantenarchitectuur, kan heel erg veranderen en wordt be\u00efnvloed door meerdere factoren en kan belangrijk zijn om te overleven in diens omgeving. Zo is er niet alleen verschil tussen soorten maar ook binnen dezelfde soort kan er veel verschil zitten. Tijdens evolutie is er zo een grote variatie aan verschillende planten en hoe ze eruit zien ontstaan. Toen mensen bepaalde plantensoorten gingen telen, werd er geselecteerd voor bepaalde eigenschappen in plantenarchitectuur om het gebruik voor de mens te verbeteren. Sommige van deze belangrijke eigenschappen zijn op een moleculair niveau aan elkaar gekoppeld. Dat betekent dat wanneer je de ene eigenschap wil sturen, je vaak ook andere eigenschappen mee verandert. Bij gerst is dit ook het geval, waarbij het aantal zijscheuten en rij-type, het aantal graankorrels per aar, door dezelfde transcriptiefactor gereguleerd wordt, namelijk VULGARE ROW-TYPE SIX 5 (VRS5). Beide eigenschappen zijn belangrijk voor de uiteindelijke opbrengst, en door deze genetische koppeling is het moeilijk om deze eigenschappen onafhankelijk van elkaar te sturen. Het overkoepelende doel in dit proefschrift is om op moleculair niveau beter te begrijpen hoe deze eigenschappen aan elkaar gekoppeld zijn, met de focus op VRS5.\n\nVRS5 is een transcriptiefactor, dat betekent dat het de expressie van onderliggende genen kan reguleren door direct aan DNA te binden. Door te onderzoeken welke genen dit precies zijn, kunnen we beter begrijpen hoe VRS5 precies werkt en hoe het verschillende eigenschappen kan be\u00efnvloeden. In Hoofdstuk 2, hebben we deze onderliggende genen ge\u00efdentificeerd door twee technieken te combineren. Door gebruik te maken van DNA-affinity purification gevolgd door sequencing (DAP-seq), hebben we over het hele gerstgenoom de locaties gevonden waar VRS5 bindt. Daarnaast hebben we de genexpressie vergeleken van wild-type planten en planten die een mutatie hebben in VRS5, oftewel vrs5 mutanten, in vier verschillende ontwikkelingsstadia met RNA-sequencing. Door de verschillend gereguleerde genen in vrs5 planten te combineren met de locaties in het genoom waar VRS5 bindt, hebben we een lijst met genen die zowel gebonden als gereguleerd worden door VRS5. Door dit in vier verschillende ontwikkelingsstadia te doen, konden we zien welke van deze onderliggende genen vooral vroeg in de ontwikkeling, en waarschijnlijk dus bij het maken van zijscheuten belangrijk zijn, terwijl andere, die vooral later in de ontwikkeling, en dus pas bij de ontwikkeling van de aar, belangrijk zijn.\n\nVervolgens hebben we in meer detail gekeken naar VRS5 als eiwit in Hoofdstuk 3. We hebben gevonden dat er twee verschillende VRS5 eiwitten gevormd kunnen worden; VRS5\u03b1 en VRS5\u03b2. We wilden onderzoeken of deze verschillende isoformen ook een anders functioneren. Door gebruik te maken van CRISPR mutagenese, hebben we een mutatie gemaakt waardoor er maar een van deze isoformen gevormd kan worden. We zagen dat in deze planten de koppeling tussen het vormen van zijscheuten en het rij-type verdwenen is. vrs5 mutanten, waarbij geen enkel VRS5 eiwit gevormd kan worden, hebben zowel meer zijscheuten, als een aar met zes rijen graankorrels. vrs5\u03b1 mutanten, waarbij alleen VRS5\u03b2 gevormd kan worden, hebben meer zijscheuten, maar een aar met twee rijen graankorrels. We laten verder zien dat deze verschillen waarschijnlijk veroorzaakt worden door verschillen in de DNA-binding van de verschillende isoformen als ze een complex vormen met een andere transcriptiefactor, TB2.\n\nEen van de direct onderliggende genen van VRS5 die we in Hoofdstuk 2 ge\u00efdentificeerd hebben, VRS1, was in gerst al bekend als een gen dat rij-type reguleert. Hoewel rij-type een erg belangrijke agronomische eigenschap is voor gerst, is er moleculair erg weinig bekend over hoe VRS1 functioneert. In Hoofdstuk 4, hebben we aangetoond aan welke DNA-sequentie VRS1 kan binden als transcriptiefactor, door gebruik te maken van DAP-seq. In combinatie met bestaande genexpressiedata van een VRS1 allel, hebben we ook mogelijke direct onderliggende genen van VRS1 ge\u00efdentificeerd. Een van deze genen is SOC1-like, waar we met CRISPR ook mutanten van hebben gemaakt. Deze mutanten hebben net als wild-type een twee-rijige aar, maar de laterale graankorrels in soc1-like mutanten zijn significant kleiner vergeleken met die van wild-type. Door natuurlijke variatie in de DNA-sequentie van SOC1-like te analyseren, zagen we dat er een sterke selectie is geweest voor een bepaalde mutatie in SOC1-like in zes-rijige gerst.\n\nVeel van de experimenten die in dit proefschrift gedaan zijn, zouden onmogelijk zijn zonder een effici\u00ebnt CRISPR mutagenese protocol. In Hoofdstuk 5 hebben we laten zien hoe we de effici\u00ebntie van Cas9 in gerst hebben verbeterd door verschillende methodes te combineren. Met dit verbeterde systeem hebben we veel planten ontwikkeld met knock-out mutaties en zelfs knock-out mutaties van twee genen tegelijk, al in de primaire transformanten.\n\nUiteindelijk combineer ik in Hoofdstuk 6 de behaalde resultaten en plaats ze samen in een breder wetenschappelijk perspectief. Ik benoem specifiek de geconserveerde functie van VRS5 in het reguleren van het maken van zijscheuten, terwijl ik sommige interessante direct onderliggende genen van VRS5 benoem die mogelijk de ontwikkeling van laterale graankorrels reguleren. Met de moleculaire inzichten uit dit proefschrift laat ik meerdere opties zien die helpen bij het ontkoppelen van verschillende opbrengsteigenschappen in gerst, specifiek via VRS5.","summary":"Plant architecture is a highly dynamic trait that can be influenced by many factors. Because of this, evolutionary adaptation created an immense variation in plant architecture across the plant kingdom. Also during domestication, several plant architectural traits were targeted to improve human usability of crops. Several important traits are tangled on a molecular level, meaning that changing one trait, often changes other traits as well. This is also the case in barley, where the transcription factor VRS5, regulates both tiller development and lateral spikelet development. Both of these processes are important yield related traits in barley, and their genetic connection makes it difficult to manipulate these traits independently. The main objective in this thesis was to provide molecular insights that can help untangle these traits, with the focus on VRS5.\n\nAs a transcription factor, VRS5 can directly bind to DNA and regulate the expression of downstream targets. Understanding what these targets are, can help to better understand how VRS5 exactly functions and regulates these different processes. In Chapter 2, we identified these direct targets in barley by combining two techniques. Using DNA-affinity purification followed by sequencing (DAP-seq), we identified the genome-wide binding sites of VRS5. Next to that, we compared gene expression in vrs5 mutants to wild-type at four developmental stages using RNA sequencing. By combining the genes that are differentially expressed in vrs5 and the loci where VRS5 binds, we obtained a set of direct VRS5 targets that are thus bound by and regulated by VRS5. We investigated four different developmental stages and therefore we could identify which of these targets mostly play a role early in development, and presumably in tillering, while others mostly play a role later in development, when the inflorescence is developing.\n\nNext, we looked in more detail at VRS5 as a protein in Chapter 3. We found that in barley two different protein isoforms of VRS5 are formed; VRS5\u03b1 and VRS5\u03b2. We wanted to know if these isoforms function differently, and by CRISPR mutagenesis we made mutations causing only one of the protein isoforms to be formed. After investigating these lines, we found that it is possible to uncouple the tillering from the row-type function. While complete knock-out lines of vrs5 have both an increased number of tillers and six-rowed to intermediate spike phenotype, the vrs5\u03b1 mutants only show increased tillering, but a two-rowed spike. We showed that these phenotypical differences are likely caused by differences in DNA binding of the isoforms in complex with another transcription factor, TB2.\n\nOne of the direct targets of VRS5 identified in Chapter 2, VRS1 was already known as thus far the most downstream regulator of lateral spikelet development. Despite this role in such an agronomically important trait, little is known of the molecular function of VRS1. In Chapter 4, we identified the consensus DNA binding motif of VRS1, using DAP-seq. In combination with an already available RNA-seq dataset of a VRS1 allele, we also identified some potential direct downstream targets of VRS1. One of these targets was SOC1-like, of which we made CRISPR mutants. These mutants showed significantly smaller lateral spikelets compared to WT. Analysis of natural variation in SOC1-like revealed that there has been a strong selection for a frameshift mutation of SOC1-like in six-rowed barleys.\n\nMany of the experiments performed in this thesis would be impossible without having an efficient CRISPR based mutagenesis protocol. In Chapter 5, we showed how we greatly improved the editing efficiency of Cas9 in barley by using several methods shown to improve editing efficiency. With this improved system we were able to generate multiple knock-out lines and even double knock-outs in primary transformants already.\n\nFinally, in Chapter 6 I combined the obtained results and place them in a broader scientific perspective. I highlight the conserved function of VRS5 in regulating tillering, while some interesting VRS5 targets that might regulate lateral spikelet development are discussed. In conclusion, with the molecular insights provided in this thesis, I showed several potential ways to help untangle yield-related traits in barley, specifically via VRS5.","auteur":"Ton Winkelmolen","auteur_slug":"ton-winkelmolen","publicatiedatum":"12 juni 2026","taal":"EN","url_flipbook":"https:\/\/ebook.proefschriftmaken.nl\/ebook\/tonwinkelmolen?iframe=true","url_download_pdf":"https:\/\/ebook.proefschriftmaken.nl\/download\/9a6e4924-e607-410c-b46b-7a81e4e5f576\/optimized","url_epub":"","ordernummer":"18706","isbn":"","doi_nummer":"","naam_universiteit":"Wageningen University","afbeeldingen":14612,"naam_student:":"","binnenwerk":"","universiteit":"Wageningen University","cover":"","afwerking":"","cover_afwerking":"","design":""},"_links":{"self":[{"href":"https:\/\/www.proefschriftmaken.nl\/en\/wp-json\/wp\/v2\/us_portfolio\/14610","targetHints":{"allow":["GET"]}}],"collection":[{"href":"https:\/\/www.proefschriftmaken.nl\/en\/wp-json\/wp\/v2\/us_portfolio"}],"about":[{"href":"https:\/\/www.proefschriftmaken.nl\/en\/wp-json\/wp\/v2\/types\/us_portfolio"}],"author":[{"embeddable":true,"href":"https:\/\/www.proefschriftmaken.nl\/en\/wp-json\/wp\/v2\/users\/7"}],"replies":[{"embeddable":true,"href":"https:\/\/www.proefschriftmaken.nl\/en\/wp-json\/wp\/v2\/comments?post=14610"}],"version-history":[{"count":1,"href":"https:\/\/www.proefschriftmaken.nl\/en\/wp-json\/wp\/v2\/us_portfolio\/14610\/revisions"}],"predecessor-version":[{"id":14613,"href":"https:\/\/www.proefschriftmaken.nl\/en\/wp-json\/wp\/v2\/us_portfolio\/14610\/revisions\/14613"}],"wp:featuredmedia":[{"embeddable":true,"href":"https:\/\/www.proefschriftmaken.nl\/en\/wp-json\/wp\/v2\/media\/14611"}],"wp:attachment":[{"href":"https:\/\/www.proefschriftmaken.nl\/en\/wp-json\/wp\/v2\/media?parent=14610"}],"wp:term":[{"taxonomy":"us_portfolio_category","embeddable":true,"href":"https:\/\/www.proefschriftmaken.nl\/en\/wp-json\/wp\/v2\/us_portfolio_category?post=14610"}],"curies":[{"name":"wp","href":"https:\/\/api.w.org\/{rel}","templated":true}]}}