{"id":14497,"date":"2026-03-19T13:22:14","date_gmt":"2026-03-19T12:22:14","guid":{"rendered":"https:\/\/www.proefschriftmaken.nl\/us_portfolio\/arina-buizer-2\/"},"modified":"2026-08-14T17:46:47","modified_gmt":"2026-08-14T15:46:47","slug":"arina-buizer","status":"publish","type":"us_portfolio","link":"https:\/\/www.proefschriftmaken.nl\/en\/portfolio\/arina-buizer\/","title":{"rendered":"Arina Buizer"},"content":{"rendered":"","protected":false},"featured_media":7996,"template":"","meta":{"_acf_changed":false},"university_us_portfolio":[18],"class_list":["post-14497","us_portfolio","type-us_portfolio","status-publish","has-post-thumbnail","hentry","university_us_portfolio-rijksuniversiteit-groningen"],"acf":{"main_text":"","naam_van_het_proefschift":"Towards in vivo application of oxygen-releasing microspheres for enhancing bone regeneration","samenvatting":"De stappen die genomen zijn om de toepassing van zuurstof afgevende microbolletjes voor het verbeteren van de regeneratie van bot te vertalen van laboratoriumtafel naar in vivo toepassing worden in dit proefschrift beschreven.\n\nOp dit moment is de gouden standaard voor het repareren van botdefecten het gebruik van autoloog bot. De belangrijkste nadelen van het gebruik van autoloog bot zijn het v\u00f3\u00f3rkomen van morbiditeit ter plaatse van de oogstlocatie van het bot, het feit dat er een extra ingreep nodig is (met de bijkomende kosten) voor het oogsten van een bottransplantaat en de beperkte beschikbaarheid van autologe bottransplantaten. Daarom worden de mogelijkheden voor het regenereren van botweefsel steeds meer onderzocht. Met name wordt veel onderzoek gedaan naar botregeneratie middels een scaffold die ingezaaid wordt met cellen die het vermogen hebben botweefsel te vormen. Menselijke mesenchymale stamcellen (hMSC) hebben het vermogen bot te vormen, ze zijn gemakkelijk te verkrijgen en ze hebben trofische effecten. hMSCs zijn door deze eigenschappen een gewild celtype om op scaffolds voor botregeneratie te zaaien. De vascularisatie van scaffolds die ingezaaid zijn met cellen blijft nog een belangrijk punt. Op het moment dat een scaffold in het lichaam ge\u00efmplanteerd wordt, worden de cellen die op de scaffold gezaaid zijn blootgesteld aan langdurige ischemische omstandigheden, omdat ze vaak ge\u00efmplanteerd worden op loci met verstoorde vascularisatie en omdat er in een scaffold geen vascularisatie aanwezig is. Vooral de cellen die zich in het centrum van de scaffold bevinden krijgen niet voldoende zuurstof om te overleven, waardoor de kwaliteit van de botregeneratie maar matig is. Wanneer hMSCs worden blootgesteld aan ischemie, gaan ze angiogene groeifactoren (AGF) produceren. Die AGF stimuleren de ingroei van bloedvaten. Door de opbouw van een vasculair netwerk in een scaffold ingezaaid met cellen wordt een duurzame zuurstofvoorziening opgezet. Door de aanwezigheid van zo\u2019n duurzame zuurstofvoorziening kunnen hogere aantallen cellen die op een scaffold gezaaid zijn overleven, en zo kan een optimale botregeneratie bereikt kunnen worden. Er zijn microbolletjes die geleidelijk aan zuurstof afgeven ontwikkeld, ten eerste om de overleving van hMSCs in de eerste weken na implantatie in het lichaam te verhogen. Ten tweede, door maar een klein beetje zuurstof af te geven wordt de productie van AGF door hMSCs gestimuleerd, waarmee het opbouwen van een duurzame zuurstofvoorziening op de langere termijn wordt ondersteund. De zuurstof afgevende microbolletjes worden gemaakt met poly (trimethylene carbonate) (PTMC) als matrixmateriaal en calcium peroxide partikels (CaO2) als zuurstofdonor. CaO2 reageert met water volgens onderstaande chemische reacties, resulterend in de productie van zuurstof.\n\nCaO2 + 2 H2O \u2192 Ca(OH)2 + H2O2\n2 H2O2 \u2192 O2 + 2 H2O\n\nPTMC wordt afgebroken middels een oppervlakte erosie-proces, wat inhoudt dat de CaO2 partikels die door de PTMC matrix verspreid zijn geleidelijk aan aan water blootgesteld worden. Op deze manier is een systeem dat geleidelijk aan zuurstof afgeeft gecre\u00eberd.\n\nDe doelen van dit proefschrift zijn:\n\n\u2022 Onderzoeken welke methode het meest geschikt is voor het zaaien van cellen op biomaterialen met hoge en met lage porositeit;\n\u2022 Onderzoeken bij welk zuurstofpercentage hMSCs zich het beste prolifereren en tegelijkertijd AGF produceren;\n\u2022 Het ontwikkelen van een methode om PTMC-CaO2 microbolletjes te produceren en te onderzoeken hoe het zuurstof afgifteprofiel van deze microbolletjes is;\n\u2022 Kijken of de zuurstof afgevende microbolletjes biocompatibel zijn in vitro en in vivo;\n\u2022 Onderzoeken of de toepassing van zuurstof afgevende microbolletjes de overleving van ischemisch weefsel verbetert in vivo.\n\nIn Hoofdstuk 2 wordt een statische en een vacu\u00fcmmethode voor het zaaien van hMSC op een scaffold met lage en een scaffold met hoge porositeit vergeleken. Drie verschillende celzaaidichtheden worden vergeleken voor het gebruik op een scaffold met hoge porositeit. De levensvatbaarheid van de cellen, de celproliferatie en de celzaaihomogeniteit zijn de eindpunten in deze studie. hMSCs werden ge\u00efsoleerd uit het beenmerg dat vrijkwam bij het opraspen van de femurschacht bij het plaatsen van een totale heuparthroplastiek. De cellen die op deze manier verkregen zijn, zijn gebruikt bij alle hMSC-experimenten die in dit proefschrift beschreven zijn. De cellen zijn gekarakteriseerd volgens de richtlijnen die opgesteld zijn door de International Society for Cellular Therapy (ISCT) en het celprofiel voldeed aan de ISCT richtlijnen. Ongeacht welke celzaaimethode gebruikt werd, zowel in scaffolds met hoge als met lage porositeit, was er een hogere celadherentie aan de buitenkant van de scaffold dan aan de binnenkant. Bij scaffolds met een lage porositeit resulteerde de vacu\u00fcm celzaaimethode in de meest homogene celzaaiing en het hogere aantallen adherente cellen aan de scaffold dan de statische celzaaimethode. Op de scaffolds met hoge porositeit resulteerde juist de statische celzaaimethode in de meest homogene celzaaiing en het hogere aantallen adherente cellen aan de scaffold dan de vacu\u00fcm celzaaimethode. Het toepassen van vacu\u00fcm op de cellen resulteerde niet in een verminderde hMSC proliferatie. De absolute aantallen cellen op de scaffolds nam af in de tijd na het zaaien op beide types scaffolds en met beide celzaaimethodes. Beide celzaaimethodes hadden een zaaieffici\u00ebntie van rond de 90%. Op scaffolds met een lage porositeit gaf de hoogste celzaaidichtheid ook het hoogste aantal adherente cellen aan de scaffold.\n\nIn Hoofdstuk 3 wordt het zuurstofbereik waarin hMSCs prolifereren, metabool actief zijn en er tegelijkertijd transcriptie van AGF plaatsvindt, onderzocht. De proliferatie van hMSC was het hoogste bij 1% zuurstof. Bij 21% zuurstof, wat in feite voor uit beenmerg afkomstige hMSCs een hyperoxische situatie is, lieten de cellen de hoogste gecorrigeerde metabole activiteit zien. Bij omstandigheden met hypoxie was de gecorrigeerde metabole activiteit het hoogste bij 2% zuurstof. De transcriptie van AGF onder hypoxische omstandigheden is gerelateerd aan de transcriptie van AGF wanneer hMSCs blootgesteld worden aan 21% zuurstof. Aangezien HIF-1\u03b1-transcriptie standaard gebeurt, werd al verwacht dat de transcriptie van HIF-1\u03b1 onder hypoxische condities niet significant verschilde van de transcriptie onder normoxische condities. De transcriptie van VEGF en ANG-1 daarentegen was significant hoger bij 2% O2 dan bij 21% zuurstof. Daarom concluderen we dat het zuurstofbereik waarin uit beenmerg afkomstige hMSCs een hoge celproliferatie vertonen, metabool actief zijn en een hoge transcriptie van AGF vertonen, 1-2% O2 is.\n\nIn Hoofdstuk 4 wordt een methode om zuurstof afgevende PTMC-CaO2 microbolletjes te maken beschreven. Daarnaast wordt het zuurstofafgifteprofiel van de aldus geproduceerde microbolletjes beschreven en wordt het effect van de aanwezigheid van de microbolletjes op de metabole activiteit van hMSCs die gekweekt worden onder omstandigheden met hypoxie onderzocht. Aangezien de microbolletjes zuurstof gaan afgeven op het moment dat zij in contact komen met water moet contact met water tijdens het productieproces vermeden worden. Daarom is een olie-in-olie oplosmiddel verdampingsmethode gebruikt, en polydisperse microbolletjes met een maximale diameter van 200 \u03bcm werden hiermee geproduceerd. In vitro, in simulated body fluid met daarin cholesterol esterase, gaven de PTMC-CaO2 microbolletjes zuurstof af gedurende ongeveer 20 dagen. De aanwezigheid van PTMC-CaO2 microbolletjes leidde tot hogere adherentie van hMSCs aan de microbolletjes dan aan celkweekplastic, wat suggereert dat de bolletjes niet cytotoxisch zijn. hMSCs hebben een hogere metabole activiteit wanneer zij onder hypoxische omstandigheden gekweekt worden in de aanwezigheid van zuurstof afgevende microbolletjes dan in de aanwezigheid van niet-zuurstof afgevende bolletjes na 7 dagen kweken. Dit suggereert dat de zuurstofafgifte vanuit de microbolletjes de hMSC-overleving verhoogt na langdurige blootstelling aan hypoxische omstandigheden.\n\nDe biocompatibiliteit van de zuurstof afgevende PTMC-CaO2 microbolletjes is onderzocht middels in vitro and in vivo tests, die gebaseerd zijn op ISO standard 10993-5. Deze worden beschreven in Hoofdstuk 5. Bij de in vitro tests, waarbij L929 muizenfibroblasten gekweekt werden met een PTMC-CaO2 microbolletjesextract in verschillende concentraties, werd cytotoxiciteit van hoge concentraties van het extract aangetoond. Lagere concentraties van het extract daarentegen, die meer in de buurt komen van de verwachte in vivo concentraties, leidden niet tot verhoogde celdood. Dit werd bevestigd in de in vivo tests. Wanneer de PTMC-CaO2 microbolletjes ge\u00efmplanteerd werden in subcutane pockets in muizen, werden geen nadelige effecten geobserveerd. Concluderend: de zuurstof afgevende microbolletjes zijn biocompatibel.\n\nAls bewijs van het principe werden de zuurstof afgevende PTMC-CaO2 microbolletjes ge\u00efmplanteerd onder een met op toeval gebaseerde restvaatvoorziening, maar verder gedevasculariseerde huidflap in muizen (verder \u2018gedevasculariseerde huidflap\u2019 genoemd). De resultaten worden beschreven in Hoofdstuk 6. Histologische analyse van de huidflappen toonde aan dat de hoeveelheid necrose van het huidweefsel toenam vanaf de craniale basis van de flap richting het caudale einde van de flap. Dit impliceert dat er sprake is van een ischemische gradi\u00ebnt in de huidflap, waarbij de craniale basis van de huidflap goed gevasculariseerd en niet ischemisch is, en het caudale uiteinde van de flap het slechtst gevasculariseerd en daarmee het meest ischemisch is. Huidflappen waaronder niet-zuurstof afgevende PTMC microbolletjes ge\u00efmplanteerd zijn, lieten significant meer necrose zien dan huidflappen waaronder zuurstof afgevende PTMC-CaO2 microbolletjes ge\u00efmplanteerd zijn op 3, 7 en 10 dagen na implantatie. Deze bevindingen suggereren dat de afgifte van zuurstof door de PTMC-CaO2 microbolletjes celdood kan voorkomen bij cellen die aan ischemische omstandigheden blootgesteld worden, waardoor de overleving van ischemisch weefsel verbeterd kan worden.\n\nDe uitkomsten van dit onderzoeksproject worden bediscussieerd en suggesties voor toekomstig onderzoek worden gegeven in Hoofdstuk 7, de algemene discussie. De zuurstof afgevende PTMC-CaO2 microbolletjes die onderzocht zijn in dit proefschrift zijn getest in een toepassing in huidweefsel in muizen. Het zou interessant zijn ook toepassingen in andere weefsels te onderzoeken, zoals botweefsel of hartspierweefsel. In slecht gevasculariseerd weefsel ondervinden cellen niet alleen een tekort aan zuurstof, maar ook aan andere nutri\u00ebnten, zoals glucose, aminozuren en vitamines. Het suppleren van meer nutri\u00ebnten dan glucose alleen aan cellen die aan ischemie blootgesteld worden zou de celoverleving ook verder kunnen verhogen. Dit is verder onderzoek waard. In dit onderzoeksproject zijn microbolletjes ontwikkeld die gedurende drie weken zuurstof afgeven. Wellicht is nog een langduriger zuurstofafgifte te bereiken door het matrixmateriaal aan te passen.\n\nConcluderend: zuurstof afgevende PTMC-CaO2 microbolletjes, die in vitro gedurende ongeveer 20 dagen zuurstof afgaven, zijn geproduceerd. Bij in vivo tests bleken de microbolletjes biocompatibel te zijn en ze verminderden huidnecrose significant wanneer ze ge\u00efmplanteerd werden onder een gedevasculariseerde huidflap in muizen gedurende 10 dagen. Dit suggereert dat de zuurstof afgevende PTMC-CaO2 microbolletjes de celoverleving in ischemische weefsels faciliteren en weefselregeneratie onder ischemische omstandigheden kunnen verbeteren.\n\nVoor niet-deskundigen\n\nDoor verschillende redenen kan het gebeuren dat er in het lichaam extra botweefsel nodig is, bijvoorbeeld als door een botbreuk of een infectie botweefsel verloren gegaan is. Als er maar een klein stukje bot mist, kan het lichaam daar wel weer nieuw bot in laten groeien. Dat lukt het lichaam niet wanneer er meer dan een paar millimeter bot mist. Om dan toch zo\u2019n bottekort op te vullen, wordt er nu vaak door artsen ergens anders uit het lichaam van de pati\u00ebnt bot weggehaald, bijvoorbeeld uit het bekken, en dat wordt dan op een plek met bottekort weer in het lichaam gezet. Het gebruik van bot elders uit het lichaam heeft ook nadelen. Er is namelijk maar een beperkte hoeveelheid bot dat gebruikt kan worden om bottekorten op te vullen, pati\u00ebnten houden vaak last van de plaats waar extra bot weggehaald is en er is een extra operatie nodig om bot weg te halen. Het zou daarom erg mooi zijn als het lukt om op een plek waar je meer dan een paar millimeter bot tekort hebt, weer nieuw bot te laten groeien.\n\nEr zijn kunstmaterialen te krijgen waarop en waarin het lichaam bot kan laten groeien. Daarvoor moet je die materialen als het ware inzaaien met cellen die bot kunnen vormen. Botvormende cellen zitten natuurlijk in bot zelf. Op veel andere plaatsen in het menselijk lichaam zitten cellen die nog geen botvormende cel zijn, maar dat wel kunnen worden. Dit zijn stamcellen. Ze worden zo genoemd omdat ze nog in verschillende celsoorten kunnen veranderen, in tegenstelling tot bijvoorbeeld vetcellen, huidcellen en bloedcellen. Deze stamcellen bevinden zich veel in het beenmerg en in het vetweefsel. Het gebruik van stamcellen heeft belangrijke voordelen ten opzichte van het gebruik van botcellen. Stamcellen zijn namelijk gemakkelijk uit beenmerg en vet te halen en ze zijn in vrij ruime hoeveelheid beschikbaar. Om aan kant-en-klare botcellen te komen, moet je botweefsel uit het lichaam halen om daar weer de cellen uit te halen. Bovendien is het ook erg lastig dan de botcellen levend uit het bot te krijgen, en al helemaal om veel botcellen te verkrijgen. Botcellen zijn dus niet zo geschikt om te gebruiken om een tekort aan bot op te vullen.\n\nOm tekorten aan bot van hoogstens enkele millimeters groot weer dicht te laten groeien met botweefsel is zo\u2019n kunstmateriaal met daarop stamcellen gezaaid redelijk geschikt; het lukt dan vaak wel om nieuw bot te laten groeien. Grotere bottekorten blijven vaak wel een probleem. Een belangrijke oorzaak daarvoor is dat in kunstmaterialen geen bloedvaten zitten. In ons lichaam zitten heel veel bloedvaten, zodat bij alle cellen in het lichaam bloed kan komen. In het bloed zit onder meer zuurstof en allerlei voedingsstoffen. Om cellen niet dood te laten gaan, hebben ze zuurstof en voedingsstoffen nodig. Als cellen dus op zo\u2019n kunstmateriaal gezaaid zijn, maar geen zuurstof en voedingsstoffen krijgen omdat er geen bloedvaten zijn, gaan ze dood. Dan groeit er dus ook geen bot. Bij wat kleinere bottekorten kan er nog wel wat zuurstof en voedingsstoffen uit de omgeving doorsijpelen naar de cellen, maar bij grote bottekorten is dat onvoldoende. Vooral in het midden van zo\u2019n bottekort groeit er dan geen nieuw botweefsel. Een goede aanvoer van zuurstof en voedingsstoffen is dus heel belangrijk voor het herstellen van botweefsel.\n\nMet onze onderzoeksgroep hebben we hiervoor een oplossing bedacht. We hebben hele kleine bolletjes gemaakt die zuurstof afgeven. Ze worden laagje voor laagje afgebroken in het lichaam, en zo geven ze voor ongeveer 3 weken steeds een beetje zuurstof af. Die bolletjes kunnen gemengd worden met een kunstmateriaal om bot te vervangen. De stamcellen die op het kunstmateriaal zitten krijgen daarmee een soort van lunchbox met zuurstof mee op het moment dat ze in het lichaam geplaatst worden. Door de cellen wat extra zuurstof mee te geven hopen we dat de cellen langer overleven en dus meer tijd hebben om bot te laten groeien. Ook kunnen dan vanuit de omgeving bloedvaten ingroeien, zodat ook een langdurige bloedvoorziening ontstaat.\n\nIn het tweede hoofdstuk van dit boek staat beschreven hoe je het beste cellen kan inzaaien in kunstmaterialen. Dit verschilt een beetje per kunstmateriaal. We raden gebruikers van die kunstmaterialen dus aan om \u00f3f zelf te testen welke manier van cellen zaaien het beste werkt voor het materiaal dat ze gebruiken \u00f3f om te kijken wat bij andere onderzoekers het beste werkt voor het zaaien van cellen op een kunstmateriaal. Verder hebben we gekeken hoe de stamcellen, die wij uit beenmerg hebben gehaald, reageren op zuurstof. De resultaten hiervan staan in hoofdstuk 3. Als de cellen in een omgeving met 1-2% zuurstof gebracht worden, groeien ze snel, maar maken ze gelijk ook stofjes aan die ervoor zorgen dat er meer bloedvaten ingroeien. Als ze aan meer of minder zuurstof dan 1-2% blootgesteld worden, maken ze die stofjes niet meer aan, en groeien ze ook minder hard. Wat belangrijk is hierbij te bedenken, is dat we dit in het laboratorium getest hebben, met cellen die in een schaaltje gekweekt zijn. Het kan dus zijn dat als de stamcellen in het lichaam geplaatst worden, ze anders reageren op zuurstof. Dit moet nog verder onderzocht worden. In hoofdstuk 4 staat hoe de zuurstof afgevende bolletjes precies gemaakt worden. Ook hebben we gekeken hoe lang ze zuurstof afgeven. Dit blijkt bij laboratoriumtesten 3 weken te zijn. Voor hoofdstuk 5 hebben we getest met proeven in een laboratorium en met een proef met muizen of de bolletjes niet afgestoten worden door het lichaam. Het lichaam blijkt er gelukkig goed tegen te kunnen. Uiteindelijk wilden we ook weten of de zuurstof afgevende bolletjes ook helpen om weefsels waarin zuurstoftekort is toch in leven te houden. We hebben daarvoor bij muizen een huidflap op de rug gemaakt, waarvan de bloedvaten grotendeels doorgesneden waren. Bij de muizen die niet- zuurstof afgevende bolletjes onder de huidflap hadden gekregen ging het huidweefsel sneller dood dan bij muizen die wel zuurstof afgevende bolletjes onder de huidflap hadden gekregen. We denken dus dat de zuurstof afgevende bolletjes inderdaad helpen om weefsels waarin een zuurstoftekort is te laten overleven.\n\nDeze resultaten lijken erg mooi, maar er zijn nog wel dingen die we misschien nog kunnen verbeteren. We weten immers nog niet of de zuurstof afgevende bolletjes ook helpen om meer botweefsel te vormen op een plek waar we dat willen. Daarvoor moeten de bolletjes nog in bot getest worden in plaats van alleen bij de huid. Ook kunnen we de bolletjes misschien nog verder aanpassen, zodat ze nog langer dan 3 weken zuurstof afgeven. Daarnaast geven de bolletjes alleen zuurstof af en geen andere voedingsstoffen, terwijl die ook nodig zijn. Misschien kunnen we in de toekomst ook wel bolletjes maken die ook voedingsstoffen afgeven.","summary":"In this thesis, the steps taken to translate the use of oxygen-releasing microspheres for enhancing bone regeneration from lab bench to in vivo application are described.\n\nAt this moment, the golden standard for repairing bone defects is the use of autologous bone. The main disadvantages of the use of autologous bone grafts are the occurrence of donor site morbidity, the (cost of an) extra surgical procedure that is needed for harvesting bone tissue and the limited availability of autologous bone. Therefore, bone regeneration options are explored increasingly. Especially, bone regeneration using scaffolds seeded with cells that have the capacity to form bone is frequently studied. Human mesenchymal stem cells (hMSC) have the capacity to form bone, they are easy to harvest and they show trophic effects. These properties make hMSCs a favorable cell type to seed on scaffolds for bone regeneration. The vascularization in cell-scaffold complexes is an important issue to be addressed. At the moment of implantation in the body, the seeded hMSCs are exposed to prolonged ischemic circumstances, because they are often implanted in sites with disrupted vascularization and because of an absence of vascularization within the scaffold. Especially cells seeded in the center of a scaffold do not receive enough oxygen to survive, resulting in poor bone regeneration. Whenever hMSCs encounter ischemia, they start producing angiogenic factors (AGF). These AGF enhance the ingrowth of blood vessels. Through establishment of a vascular network in a cell-scaffold complex, a sustainable oxygen supply is accomplished. Due to the presence of a durable oxygen supply, higher numbers of cells seeded on a scaffold may survive and thus optimal bone regeneration could be achieved.\n\nIn these studies, microspheres that release oxygen gradually were developed, firstly to support hMSC survival in de first weeks after implantation in the body. Secondly, by releasing only small amounts of oxygen the AGF production of hMSCs is stimulated, so that the establishment of sustainable oxygen supply in the longer term is supported. The oxygen-releasing microspheres are prepared with poly (1,3-trimethylene carbonate) (PTMC) as a matrix material and calcium peroxide particles (CaO2) as oxygen donor. CaO2 reacts with water resulting in the release of oxygen according to equations below.\n\nCaO2 + 2 H2O \u2192 Ca(OH)2 + H2O2\n2 H2O2 \u2192 O2 + 2 H2O\n\nPTMC is degraded through a surface erosion process, which implies that the CaO2 particles dispersed in the PTMC matrix are exposed to water gradually. Thus, a slow oxygen release system is acquired.\n\nThe aims of this thesis are:\n\n\u2022 To assess which method is optimal for seeding cells on low and on high porosity ceramic biomaterials;\n\u2022 To evaluate which oxygen level is optimal for hMSC proliferation and angiogenic factor production;\n\u2022 To establish a PTMC-CaO2 microsphere preparation method and evaluate the oxygen release profile of these microspheres;\n\u2022 To assess biocompatibility of the oxygen-releasing microspheres in vitro and in vivo;\n\u2022 To investigate if the application of oxygen-releasing microspheres results in improved tissue survival in otherwise ischemic tissue in vivo.\n\nIn Chapter 2, a static and a vacuum cell seeding technique to seed hMSCs on high and low porosity tricalcium phosphate scaffolds are compared. Three different cell seeding densities are evaluated for use on high porosity tricalcium phosphate scaffolds. Cell viability, cell proliferation and cell seeding homogeneity are the end points in this study. hMSCs were isolated from reaming debris acquired during hip replacement surgery. Cells acquired using this method are used in all hMSC experiments described in this thesis. They were characterized according to the guidelines given by the International Society for Cellular Therapy (ISCT) and the cell profile complied with the ISCT requirements. Regardless of the cell seeding technique used, in low as well as high porosity scaffolds, more cells adhered to the outsides than to the insides of the scaffolds. In low porosity scaffolds, a vacuum cell seeding method resulted in the most homogeneous cell seeding and higher numbers of cells adherent to the scaffold than the static cell seeding technique. On high porosity scaffolds, however, the static cell seeding technique resulted in more homogeneous cell seeding and higher numbers of cells adherent to the scaffold than the vacuum cell seeding technique. The application of vacuum to the cells did not result in decreased hMSC proliferation. The absolute numbers of cells on the scaffolds decreased over time after seeding on both scaffold types and after use of both cell seeding techniques. Both cell seeding techniques tested resulted in a cell seeding efficiency of around 90%. On low porosity scaffolds the highest cell seeding density resulted in the highest number of cells adherent to the scaffold.\n\nIn Chapter 3, the oxygen range at which hMSC proliferate and are metabolically active, yet transcribe angiogenic factors, is investigated. hMSCs proliferation was found to be the highest at 1% oxygen. At 21% oxygen, which is in fact a hyperoxic situation to bone marrow-derived hMSCs, the cells showed the highest corrected cell metabolic rate. Under hypoxic circumstances, the corrected cell metabolic rate was the highest at 2% oxygen. The transcription of AGF under hypoxic circumstances was related to the transcription of AGF when hMSCs were exposed to 21% oxygen. As HIF-1\u03b1 is transcribed standard, it was expected that the transcription of HIF-1\u03b1 did not differ significantly between hypoxic and normoxic conditions. However, at 2% O2, VEGF and ANG-1 transcription was significantly higher than at 21% oxygen. Therefore, it was concluded that the oxygen range at which bone marrow-derived hMSCs show high proliferation, are metabolically active and show high transcription of AGF is at 1-2% O2.\n\nIn Chapter 4 a method to prepare oxygen-releasing PTMC-CaO2 microspheres is described. Furthermore, the oxygen release profile of the thus created microspheres is evaluated and the effect of the presence of the microspheres on the metabolic activity of hMSCs cultured under hypoxic circumstances is assessed. As the microspheres start releasing oxygen upon contact with water, contact with water should be avoided during the preparation process. Therefore, an oil-in-oil solvent evaporation method was used, and polydisperse microspheres of max 200 \u03bcm large were produced. In vitro, in simulated body fluid complemented with cholesterol esterase, the PTMC-CaO2 microspheres released oxygen for about 20 days. The presence of PTMC-CaO2 composite microspheres led to higher hMSC adherence to the microspheres than to tissue culture plastic, suggesting the spheres are not cytotoxic. When cultured under hypoxic circumstances, hMSCs showed higher metabolic activity in the presence of oxygen-releasing microspheres than in the presence of non-oxygen-releasing microspheres after 7 days of culturing, suggesting that the oxygen release from the microspheres increases hMSC survival after prolonged exposure to hypoxic circumstances.\n\nThe biocompatibility of the oxygen-releasing PTMC-CaO2 microspheres is assessed using in vitro and in vivo tests based on ISO standard 10993-5 in Chapter 5. The in vitro tests, where L929 mouse fibroblasts were cultured with several concentrations of a PTMC-CaO2 microsphere extracts, cytotoxicity of high concentrations of the extracts was shown. However, lower concentrations, which more resemble the expected in vivo concentrations, did not lead to increased cell death. This was confirmed in in vivo tests. Upon implantation of PTMC-CaO2 microspheres in subcutaneous pockets in mice, no adverse effects were observed. It was concluded that the oxygen-releasing microspheres are biocompatible.\n\nAs a proof of principle, the oxygen-releasing PTMC-CaO2 microspheres were implanted under a random pattern devascularized skin flap in mice. The results are described in Chapter 6. Histologic analysis of the skin flaps indicated that the amount of necrosis in the skin tissue increased from the cranial basis of the skin flap towards the caudal end of the flap. This implies that there is a gradient of ischemia in the skin flap, where the cranial basis of the skip flap is well-vascularized and not ischemic, and the caudal end of the flap is the least vascularized and thus is the most ischemic. Skin flaps under which non-oxygen-releasing PTMC microspheres had been implanted, showed significantly more necrosis than skin flaps under which oxygen-releasing PTMC-CaO2 microspheres had been implanted at 3, 7 and 10 days after implantation. These findings suggest that the release of oxygen by the PTMC-CaO2 microspheres may prevent cell death in cells exposed to ischemic circumstances, thereby promoting the survival of otherwise ischemic tissue.\n\nThe outcomes of this research project are discussed and suggestions for further research are given in Chapter 7, the general discussion. The oxygen-releasing PTMC-CaO2 microspheres that were studied in this thesis were tested in a skin tissue application in mice. However, it would be interesting to investigate the application in other tissues, such as bone tissue or cardiac muscle tissue as well. In malvascularized tissue, cells do not only suffer a lack of oxygen, but also of other nutrients, such as glucose, amino acids or vitamins. Supplementing more nutrients but only oxygen to ischemic cells may improve cell survival as well. This is worth further investigation. In this research project, microspheres that release oxygen for three weeks were prepared. Perhaps, through modification of the carrier material, an even more prolonged oxygen release may be accomplished.\n\nIn conclusion, oxygen-releasing PTMC-CaO2 microspheres were prepared that released oxygen in vitro for about 20 days. In in vivo tests, the microspheres were biocompatible and they significantly decreased skin necrosis in a random pattern devascularized skin flap model in mice for at least 10 days. This suggests that the oxygen-releasing PTMC-CaO2 microspheres may facilitate cell survival in ischemic tissues, and may enhance the regeneration of tissue under ischemic circumstances.","auteur":"Arina Buizer","auteur_slug":"arina-buizer","publicatiedatum":"10 januari 2018","taal":"EN","url_flipbook":"https:\/\/ebook.proefschriftmaken.nl\/ebook\/arinabuizer?iframe=true","url_download_pdf":"","url_epub":"","ordernummer":"FTP-202603191320","isbn":"978-94-034-0278-9","doi_nummer":"","naam_universiteit":"Rijksuniversiteit Groningen","afbeeldingen":7996,"video_url":"","podcast_url":"","naam_student:":"","binnenwerk":"","universiteit":"Rijksuniversiteit Groningen","cover":"","afwerking":"","cover_afwerking":"","design":""},"_links":{"self":[{"href":"https:\/\/www.proefschriftmaken.nl\/en\/wp-json\/wp\/v2\/us_portfolio\/14497","targetHints":{"allow":["GET"]}}],"collection":[{"href":"https:\/\/www.proefschriftmaken.nl\/en\/wp-json\/wp\/v2\/us_portfolio"}],"about":[{"href":"https:\/\/www.proefschriftmaken.nl\/en\/wp-json\/wp\/v2\/types\/us_portfolio"}],"wp:featuredmedia":[{"embeddable":true,"href":"https:\/\/www.proefschriftmaken.nl\/en\/wp-json\/wp\/v2\/media\/7996"}],"wp:attachment":[{"href":"https:\/\/www.proefschriftmaken.nl\/en\/wp-json\/wp\/v2\/media?parent=14497"}],"wp:term":[{"taxonomy":"university_us_portfolio","embeddable":true,"href":"https:\/\/www.proefschriftmaken.nl\/en\/wp-json\/wp\/v2\/university_us_portfolio?post=14497"}],"curies":[{"name":"wp","href":"https:\/\/api.w.org\/{rel}","templated":true}]}}