{"id":14448,"date":"2026-03-19T12:57:38","date_gmt":"2026-03-19T11:57:38","guid":{"rendered":"https:\/\/www.proefschriftmaken.nl\/us_portfolio\/anoeska-van-de-moosdijk-2\/"},"modified":"2026-08-14T17:46:43","modified_gmt":"2026-08-14T15:46:43","slug":"anoeska-van-de-moosdijk","status":"publish","type":"us_portfolio","link":"https:\/\/www.proefschriftmaken.nl\/en\/portfolio\/anoeska-van-de-moosdijk\/","title":{"rendered":"Anoeska Van De Moosdijk"},"content":{"rendered":"","protected":false},"featured_media":7985,"template":"","meta":{"_acf_changed":false},"university_us_portfolio":[26],"class_list":["post-14448","us_portfolio","type-us_portfolio","status-publish","has-post-thumbnail","hentry","university_us_portfolio-universiteit-van-amsterdam"],"acf":{"main_text":"","naam_van_het_proefschift":"Developing and analysing novel tools to study endogenous WNT signalling in mice","samenvatting":"Het menselijk lichaam is opgebouwd uit naar schatting 30 biljoen cellen. Deze zijn Het menselijk lichaam is opgebouwd uit naar schatting 30 biljoen cellen. Deze zijn Het menselijk lichaam is opgebouwd uit naar schatting 30 biljoen cellen. Deze zijn\nallen begonnen als \u00e9\u00e9n enkele cel, met de potentie om uit te groeien tot een compleet allen begonnen als \u00e9\u00e9n enkele cel, met de potentie om uit te groeien tot een compleet allen begonnen als \u00e9\u00e9n enkele cel, met de potentie om uit te groeien tot een compleet\norganisme. Wij willen beter in beeld krijgen hoe de processen die dit sturen werken. organisme. Wij willen beter in beeld krijgen hoe de processen die dit sturen werken. organisme. Wij willen beter in beeld krijgen hoe de processen die dit sturen werken. organisme. Wij willen\nDe enkele cel waarmee het begint, is een bevruchte eicel. Deze bevat de potentie De enkele cel waarmee het begint, is een bevruchte eicel. Deze bevat de potentie De enkele cel waarmee het begint, is een bevruchte eicel. Deze bevat de potentie De enkele cel waarmee het begint, is een\nom in allerlei verschillende celtypen te veranderen. Maar hoe weet die cel wat te om in allerlei verschillende celtypen te veranderen. Maar hoe weet die cel wat te om in allerlei verschillende celtypen te veranderen. Maar hoe weet die cel wat te om in allerlei verschillende celtypen te veranderen. Maar hoe weet die cel wat\ndoen? Hier komt DNA om de hoek kijken. DNA is aanwezig in alle cellen en als doen? Hier komt DNA om de hoek kijken. DNA is aanwezig in alle cellen en als doen? Hier komt DNA om de hoek kijken. DNA is aanwezig in alle cellen en als\nmolecuul waarop de genetische code is opgeslagen. Het dient als een bouwtekening molecuul waarop de genetische code is opgeslagen. Het dient als een bouwtekening molecuul waarop de genetische code is opgeslagen. Het dient als een bouwtekening molecuul waarop\nvoor het lichaam, waar alle plannen staan opgeslagen. voor het lichaam, waar alle plannen staan opgeslagen. voor het lichaam, waar alle plannen staan opgeslagen. voor het lichaam, waar alle plannen staan opgeslagen.\nMaar alleen een bouwtekening hebben is niet genoeg: als cellen zich samen Maar alleen een bouwtekening hebben is niet genoeg: als cellen zich samen Maar alleen een bouwtekening hebben is niet genoeg: als cellen zich samen\norganiseren tot een compleet lichaam, is samenwerking essentieel. Dus moeten ze organiseren tot een compleet lichaam, is samenwerking essentieel. Dus moeten ze organiseren tot een compleet lichaam, is samenwerking essentieel. Dus moeten ze\ncommuniceren. Om dit te doen, zijn er binnen cellen meerdere netwerken van communiceren. Om dit te doen, zijn er binnen cellen meerdere netwerken van communiceren. Om dit te doen, zijn er binnen cellen meerdere netwerken van\neiwitten aanwezig, die kunnen voelen wat er aan de buitenkant gebeurt en allerlei eiwitten aanwezig, die kunnen voelen wat er aan de buitenkant gebeurt en allerlei eiwitten aanwezig, die kunnen voelen wat er aan de buitenkant gebeurt en allerlei\nsignalen van buiten naar de binnenkant van de cel brengen. Dit gaat via een keten signalen van buiten naar de binnenkant van de cel brengen. Dit gaat via een keten signalen van buiten naar de binnenkant van de cel brengen. Dit gaat via een keten\nvan eiwit, naar eiwit, naar een volgend eiwit enzovoorts. Je kunt je dit voorstellen als van eiwit, naar eiwit, naar een volgend eiwit enzovoorts. Je kunt je dit voorstellen als van eiwit, naar eiwit, naar een volgend eiwit enzovoorts. Je kunt je dit voorstellen als\neen emmer water die door een rij mensen van een kraan (het signaal) naar een een emmer water die door een rij mensen van een kraan (het signaal) naar een een emmer water die door een rij mensen van een kraan (het signaal) naar een een emmer water die door een rij mensen van een kraan (het signaal)\nbrandend huis wordt gebracht, waarbij de mensen de eiwitten zijn, en het brandende brandend huis wordt gebracht, waarbij de mensen de eiwitten zijn, en het brandende brandend huis wordt gebracht, waarbij de mensen de eiwitten zijn, en het brandende brandend huis wordt gebracht, waarbij de mensen de eiwitten zijn\nhuis de kern van de cel, waar het DNA zich bevindt. Zo bereikt een signaal van huis de kern van de cel, waar het DNA zich bevindt. Zo bereikt een signaal van huis de kern van de cel, waar het DNA zich bevindt. Zo bereikt een signaal van huis d\nbuitenaf het DNA via het (in dit geval vrij simpele en directe) netwerk van eiwitten. buitenaf het DNA via het (in dit geval vrij simpele en directe) netwerk van eiwitten. buitenaf het DNA via het (in dit geval vrij simpele en directe) netwerk van eiwitten. buitenaf het DNA via het\nDe reactie die de cel dan doet, is vaak het activeren of deactiveren van specifieke De reactie die de cel dan doet, is vaak het activeren of deactiveren van specifieke De reactie die de cel dan doet, is vaak het activeren of deactiveren van specifieke\ngenen op het DNA. Deze genen bevatten een soort recept voor het maken van genen op het DNA. Deze genen bevatten een soort recept voor het maken van genen op het DNA. Deze genen bevatten een soort recept voor het maken van\neiwitten. Wanneer een gen wordt geactiveerd, kunnen dus nieuwe eiwitten worden eiwitten. Wanneer een gen wordt geactiveerd, kunnen dus nieuwe eiwitten worden eiwitten. Wanneer een gen wordt geactiveerd, kunnen dus nieuwe eiwitten worden\ngemaakt. We noemen de eiwitnetwerken die de signalen doorgeven gemaakt. We noemen de eiwitnetwerken die de signalen doorgeven gemaakt. We noemen de eiwitnetwerken die de signalen doorgeven\n\"signaleringsroutes\". \"signaleringsroutes\". \"signaleringsroutes\". \"signaleringsroutes\".\nEen signaleringsroute die essentieel is voor communicatie tijdens de Een signaleringsroute die essentieel is voor communicatie tijdens de Een signaleringsroute die essentieel is voor communicatie tijdens de Een signaleringsroute die essen\nontwikkeling en later om het lichaam in evenwicht en gezond te houden (een ontwikkeling en later om het lichaam in evenwicht en gezond te houden (een ontwikkeling en later om het lichaam in evenwicht en gezond te houden (een\ntoestand die \"homeostase\" wordt genoemd), wordt de WNT-signalering of ook wel toestand die \"homeostase\" wordt genoemd), wordt de WNT-signalering of ook wel toestand die \"homeostase\" wordt genoemd), wordt de WNT-signalering of ook wel toestand die \"homeostase\" wordt genoemd), wordt de WNT-\nWNT pathway genoemd (spreek WNT uit als \u201cwint\u201d). De WNT pathway wordt overal WNT pathway genoemd (spreek WNT uit als \u201cwint\u201d). De WNT pathway wordt overal WNT pathway genoemd (spreek WNT uit als \u201cwint\u201d). De WNT pathway wordt overal WNT pathway genoemd (spreek WNT uit als \u201cwint\u201d). De WNT pathway w\nin het dierenrijk gevonden en ook bestudeerd: van vlieg tot kikker, en van vis tot in het dierenrijk gevonden en ook bestudeerd: van vlieg tot kikker, en van vis tot in het dierenrijk gevonden en ook bestudeerd: van vlieg tot kikker, en van vis tot\nmuis en mens. WNT-signalering zorgt voor evenwicht in twee belangrijke processen: muis en mens. WNT-signalering zorgt voor evenwicht in twee belangrijke processen: muis en mens. WNT-signalering zorgt voor evenwicht in twee belangrijke processen: muis en mens. WNT-\nceldeling (\"proliferatie\") en cel specialisatie (\"differentiatie\"). Door deze in balans te celdeling (\"proliferatie\") en cel specialisatie (\"differentiatie\"). Door deze in balans te celdeling (\"proliferatie\") en cel specialisatie (\"differentiatie\"). Door deze in balans te celdeling (\"proliferatie\") en cel specialisatie (\"differentiatie\"). Door deze i & &\nhouden, zal het lichaam voldoende cellen hebben - niet te weinig of te veel - en die houden, zal het lichaam voldoende cellen hebben - niet te weinig of te veel - en die houden, zal het lichaam voldoende cellen hebben - niet te weinig of te veel - en die houden, zal het lichaam voldoende cellen hebben - niet te weinig of te veel -\ncellen zullen van het juiste type zijn en hun juiste functie vervullen, waardoor het cellen zullen van het juiste type zijn en hun juiste functie vervullen, waardoor het cellen zullen van het juiste type zijn en hun juiste functie vervullen, waardoor het\nlichaam correct werkt. Als een van deze processen wordt verstoord, kan dit tot ziekte lichaam correct werkt. Als een van deze processen wordt verstoord, kan dit tot ziekte lichaam correct werkt. Als een van deze processen wordt verstoord, kan dit tot ziekte lichaam correct werkt. Als een van deze processen wordt verstoord, kan dit\nleiden. Een heel duidelijk voorbeeld hierbij is kanker, waarbij de celdeling volledig leiden. Een heel duidelijk voorbeeld hierbij is kanker, waarbij de celdeling volledig leiden. Een heel duidelijk voorbeeld hierbij is kanker, waarbij de celdeling volledig\nuit de hand loopt. uit de hand loopt. uit de hand loopt. uit de hand loopt.\n\nAddendum\n\nWNT signalering is erg complex: zowel de muis als wij hebben maar liefst 19\nverschillende genen die coderen voor WNT-eiwitten. Verschillende celtypen in het\nlichaam brengen verschillende sets WNT-genen tot expressie. Daarnaast zijn er nog\ntientallen andere eiwitten bij de signalering betrokken tijdens het ontvangen of\nverzenden van signalen in de cel als gevolg van WNT-eiwitten. Je kunt je dit\nvoorstellen als niet \u00e9\u00e9n rij mensen die een emmertje water doorgeeft naar een brand,\nmaar de rij die verderop opsplitst of juist samenkomt, terwijl ook de politiechef een\nbericht door laat geven voor de brandweer bij het huis, de ambulance aan de andere\nkant arriveert, de pers in de weg loopt en de buren belangrijke informatie hebben.\nVanwege deze complexiteit hebben we na bijna 40 jaar onderzoek aan WNT-\nsignalering nog steeds grote vraagtekens over de exacte interacties die plaatsvinden\nin verschillende cellen wanneer ze WNT-eiwitten tegenkomen.\nIn dit proefschrift hebben we nieuwe experimentele tools ontwikkeld om beter\nte kunnen visualiseren en volgen hoe WNT-signalering de ontwikkeling en\nhomeostase van cellen en weefsels controleert, en welke eiwit interacties en\ndaaropvolgende genreacties plaatsvinden in cellen die WNT-signalen ontvangen.\n\nIeder weefsel bestaat uit een complexe 3D-omgeving, opgebouwd uit verschillende\nceltypen die allemaal hun eigen gespecialiseerde functie hebben. Zo ook\nborstweefsel: het bevat vetcellen, cellen die de melkkanalen vormen, de melkklieren\nen ook allerlei soorten ondersteunende celtypen. We weten dat WNT-signalering\nbelangrijk is voor de ontwikkeling en homeostase van borstweefsel, maar we weten\nook dat veranderingen in WNT-genexpressie (hoe hard een gen aan staat, of juist uit)\nmoeilijk te vinden zijn bij al deze verschillende celtypen, omdat de veranderingen\nvaak subtiel van aard zijn. Gevoelige technieken zijn daarom onmisbaar om deze\nsubtiele veranderingen te vinden. Omdat dit bij mensen lastig te bestuderen is,\ngebruiken we de muis als modelorganisme.\nIn hoofdstuk 2 gebruiken we een techniek genaamd qRT-PCR voor het\nbestuderen van subtiele veranderingen in genexpressie tijdens verschillende\nontwikkelingsstadia van de borst (ook wel mammary gland genoemd). Om de\nveranderingen in genexpressie goed te kunnen kwantificeren, vereist dit\nnormalisatie van de data over zogenaamde referentiegenen. Het bleek echter dat de\ntraditioneel gebruikte referentiegenen niet zo stabiel waren als nodig over\nverschillende stadia van ontwikkeling. Daarom zijn we op zoek gegaan naar nieuwe.\nDoor te zoeken naar stabiele genen in gepubliceerde genexpressie-datasets, hebben\nwe nieuwe referentiegenen weten te vinden. Vervolgens hebben we deze getest en\ngevalideerd voor qRT-PCR-experimenten van de mammary gland. Met behulp van\nde nieuwe referentiegenen Prdx1, Phf7 en Ctbp1 zijn we in staat om subtiele\nveranderingen in de expressie van WNT-genen te detecteren tussen verschillende\nontwikkelingsstadia van de borstklier.\n\nBorstweefsel groeit tijdens de puberteit uit, maar ook in een volwassen situatie zijn\nde cellen in het weefsel ontzettend actief. Elke voortplantingscyclus bereiden de\nmelkkanalen zich voor op een mogelijke zwangerschap door zich uit te breiden. Komt\ndie niet, verdwijnen de kanalen weer. Bij de muis duur zo\u2019n cyclus slechts 4-5 dagen.\nJe kunt je dus voorstellen dat de celgroei voor deze ontwikkelingen goed\ngecontroleerd moet worden. Hiervoor zijn speciale cellen, genaamd borststamcellen,\ndie heel veel celtypes in de borst kunnen maken. Wij willen weten waar die\nstamcellen zich bevinden en hoe ze precies bijdragen aan de opbouw van het\nborstklierweefsel, zowel tijdens de ontwikkeling en gedurende de cycli. In\nhoofdstuk 3 beschrijven we een methode om dit te volgen in intacte borstklieren\nvan muizen genaamd lineage tracing. Lineage tracing stelt ons in staat cellen te\nlabelen, waardoor we ze kunnen vinden in het weefsel, en ook hun dochtercellen\nkunnen volgen na celdeling. In het hoofdstuk bespreken we de voor- en nadelen van\ntwee verschillende genetische technieken om borststamcellen te kunnen volgen.\nBij lineage tracing wordt gebruik gemaakt van genetisch gemodificeerde\nmuismodellen, waarbij een muis zowel een zogenaamd \"driver-gen\" als een\n\u201creportergen\u201d in het genoom heeft. Die driver zorgt er met een soort genetische\nschakelaar voor dat de reporter aan of uit gaat. Wij kunnen de schakelaar aanzetten\ndoor de muis een stofje toe te dienen. De reporter bestaat uit een fluorescent eiwit,\ndat zichtbaar gemaakt kan worden onder een fluorescentie microscoop. Op het\nmoment dat de schakelaar dus aan wordt gezet, lichten de stamcellen op. Omdat dit\neen permanente \u201caan\u201d schakelaar betreft (er is geen \u201cuit\u201d), zal de cel de fluorescentie\ndoorgeven aan dochtercellen wanneer zij deelt. Op deze manier is zowel de stamcel\nals het nageslacht van de stamcel te volgen in een weefsel.\n\nEr zijn al verschillende driver en reporter muislijnen beschikbaar voor lineage\ntracing. We merkten echter dat de huidige drivers niet echt geschikt waren om\nstamcellen in de borstklier te bestuderen. Daarom beschrijven we in hoofdstuk 4\neen nieuw genetisch muismodel (met de naam Axin2 P2A-rtTA3-T2A-3xNLS-SGFP2 ) waar een\ndubbele functie in is gebouwd: het dient als driver voor lineage tracing, maar laat\nook de stamcellen die WNT-signalen ontvangen direct oplichten via een groen\nfluorescerend eiwit. Deze dubbele functie stelt ons in staat om cellen die WNT\nsignalen ontvangen direct op te laten lichten, en tegelijkertijd hun afkomst te volgen\nlineage tracing. Deze dubbele functie was nog niet beschikbaar voor stamcellen die\nAxin2 tot expressie brengen, een belangrijk gen dat reageert op WNT signalen in de & &\nmeeste weefsels. We laten zien dat dit nieuwe Axin2 muismodel op een juiste manier\nWNT signalering rapporteert, en dat we het ook kunnen gebruiken als een driver\nvoor lineage tracing.\n\nVervolgens hebben we ook een vernieuwde driver lijn gemaakt, zoals beschreven in\nhoofdstuk 5. Hier ontwikkelen en analyseren we een nieuwe genetische reporter\n\nAddendum\n\n(genaamd Rosa26 PRIME ). We combineren gewenste eigenschappen van verschillende\nreeds bestaande modellen met de nieuwst fluorescente eiwitten. Deze reporter bevat\nde optie zodat \u00e9\u00e9n van drie verschillende fluorescerende eiwitten (rood, cyaan en\ngeel) tot expressie komt na het aanzetten van de schakelaar. Hierdoor kunnen we\nstamcellen die vlak bij elkaar zitten beter uit elkaar houden, omdat ze verschillende\nkleuren kunnen krijgen. De reporter staat voor het aanzetten van de schakelaar in\nalle cellen van de muis reeds aan met een ver-rood fluorescerend eiwit. Dit zorgt\nervoor dat het weefsel makkelijk te bekijken is onder de microscoop.\n\nHet maken van genetisch gemanipuleerde muismodellen is een lang en uitdagend\nproces. De recent ontwikkelde CRISPR\/Cas9 genoom editing techniek belooft dat dit\nsneller kan. Om dat te testen hebben we in hoofdstuk 6 daarom getest wat we\nkunnen met CRISPR\/Cas9. Daarbij beginnend in menselijke en muis cellijnen. We\nzijn begonnen om het genoom te veranderen voor een gen dat centraal staat in WNT\nsignalering: het gen voor beta-catenine (genaamd Ctnnb1). Met hulp van\nCRISPR\/Cas9 kunnen we Ctnnb1 in cellen aanpassen, zoals een kleine mutatie\naanbrengen waardoor het resulterende eiwit altijd actief is, of zelfs een heel gen voor\neen fluorescerend eiwit inbouwen waardoor een fusie ontstaat van dat fluorescente\neiwit en beta-catenine. Vervolgens zijn we deze techniek ook gaan optimaliseren in\nmuizen embryo\u2019s, zodat we een genetisch gemodificeerde muis kunnen maken. Na\nverschillende pogingen hebben we een methode gevonden die effici\u00ebnt is, waardoor\ngemiddeld 1 op de 8 muizen de door ons ontworpen genetische modificatie draagt.\nOp deze manier hebben we muizen gemaakt die een fusie-eiwit dragen van een\nfluorescerende beta-catenine. Hierdoor kunnen we onder de microscoop precies\nvolgen hoeveel er van is in verschillende cellen, en zo leren wat het daar doet.\n\nDit proefschrift beschrijft de ontwikkeling van verschillende nieuwe gereedschappen\n(\u201ctools\u201d) om WNT signalering in het modelorganisme de muis te meten, visualiseren,\nen volgen op het daadwerkelijke niveau dat het normaal ook in de cel voorkomt.\nSamen vormen deze tools een sterke basis voor toekomstige generaties\nwetenschappers om de mechanismen van WNT signalering te bestuderen, en te\nontrafelen wat de precieze rol is van WNT signalering in ontwikkeling, homeostase\nen ziekte.","summary":"Summary\n\nThe adult human body is built out of an estimated 30 trillion cells. All of these started The adult human body is built out of an estimated 30 trillion cells. All of these startedThe adult human body is built out of an estimated 30 trillion cells. All of these started\nout as a single cell, that had the potential to grow into a whole organism. This single out as a single cell, that had the potential to grow into a whole organism. This singleout as a single cell, that had the potential to grow into a whole organism. This single out as a single cell, that had the potential to grow into a whole\ncell, the fertilized oocyte, shows huge potential to turn into different cell types, but cell, the fertilized oocyte, shows huge potential to turn into different cell types, butcell, the fertilized oocyte, shows huge potential to turn into different cell types, but\nneeds directions to know what to build. How does this work? This is where DNA needs directions to know what to build. How does this work? This is where DNAneeds directions to know what to build. How does this work? This is where DNA needs directions to know what to build. How does this work\ncomes in. DNA is present in all cells, and it is the molecule on which the genetic code comes in. DNA is present in all cells, and it is the molecule on which the genetic codecomes in. DNA is present in all cells, and it is the molecule on which the genetic code comes in. DNA is present in all cells, and it is the molecule on wh\nis stored. It serves as a blueprint of the building plans for the body. is stored. It serves as a blueprint of the building plans for the body.is stored. It serves as a blueprint of the building plans for the body. is stored. It serves as a blueprint of the building plans for the body.\nThough just having a blueprint by itself is not enough: for cells to organize Though just having a blueprint by itself is not enough: for cells to organizeThough just having a blueprint by itself is not enough: for cells to organize\nthemselves into a functional body with specialized cells and tissues, they need to be themselves into a functional body with specialized cells and tissues, they need to bethemselves into a functional body with specialized cells and tissues, they need to be\nable to work together. To achieve this, cells need to communicate. To this end, cells able to work together. To achieve this, cells need to communicate. To this end, cellsable to work together. To achieve this, cells need to communicate. To this end, cells\nhave multiple networks of proteins inside them that can sense what is happening on have multiple networks of proteins inside them that can sense what is happening onhave multiple networks of proteins inside them that can sense what is happening on\nthe outside and communicate these outside signals towards the inside of the cell. the outside and communicate these outside signals towards the inside of the cell.the outside and communicate these outside signals towards the inside of the cell.\nThey do so via a chain of protein-protein interactions going from the cells They do so via a chain of protein-protein interactions going from the cellsThey do so via a chain of protein-protein interactions going from the cells They do so via a chain of protein-protein interactions\nsurroundings towards the DNA in the centre of the cell, the nucleus. You can imagine surroundings towards the DNA in the centre of the cell, the nucleus. You can imaginesurroundings towards the DNA in the centre of the cell, the nucleus. You can imagine surroundings towards the DNA in the centre of the cell, the nucleus. Y\nthis as a bucket of water passed down a line of people from a water source towards a this as a bucket of water passed down a line of people from a water source towards athis as a bucket of water passed down a line of people from a water source towards a this as a bucket of water passed down a line of people from a water source\nburning house, with the water being the signal, the people being the proteins, and burning house, with the water being the signal, the people being the proteins, andburning house, with the water being the signal, the people being the proteins, and burning house\nthe burning house representing the nucleus of the cell where the DNA is located. So, the burning house representing the nucleus of the cell where the DNA is located. So,the burning house representing the nucleus of the cell where the DNA is located. So,\nan outside signal ultimately reaches the DNA. In response, the cell typically reacts an outside signal ultimately reaches the DNA. In response, the cell typically reactsan outside signal ultimately reaches the DNA. In response, the cell typically reacts\nby activating or inactivating specific genes, which are specific segments of DNA. One by activating or inactivating specific genes, which are specific segments of DNA. Oneby activating or inactivating specific genes, which are specific segments of DNA. One by activating or\ngene contains the instructions (a sort of recipe) to make one specific protein. Thus, gene contains the instructions (a sort of recipe) to make one specific protein. Thus,gene contains the instructions (a sort of recipe) to make one specific protein. Thus,\nwhen genes get activated, novel proteins can be made, and the cell can adjust its when genes get activated, novel proteins can be made, and the cell can adjust itswhen genes get activated, novel proteins can be made, and the cell can adjust its when genes get activated, novel proteins can be made,\nbehaviour. We call the protein networks that are responsible for passing down the behaviour. We call the protein networks that are responsible for passing down thebehaviour. We call the protein networks that are responsible for passing down the behaviour. We call\nsignals \u201csignalling pathways\u201d. signals \u201csignalling pathways\u201d.signals \u201csignalling pathways\u201d. signals \u201csignalling pathways\u201d.\nOne signalling pathway that is essential for communication during embryonic One signalling pathway that is essential for communication during embryonicOne signalling pathway that is essential for communication during embryonic\ndevelopment and later in keeping the body balanced and healthy (a state termed development and later in keeping the body balanced and healthy (a state termeddevelopment and later in keeping the body balanced and healthy (a state termed\n\u201chomeostasis\u201d), is called the WNT signalling pathway. It is found and studied \u201chomeostasis\u201d), is called the WNT signalling pathway. It is found and studied\u201chomeostasis\u201d), is called the WNT signalling pathway. It is found and studied \u201chome\nthroughout the animal kingdom: from fly to frog, and from fish to mice and humans. throughout the animal kingdom: from fly to frog, and from fish to mice and humans.throughout the animal kingdom: from fly to frog, and from fish to mice and humans.\nOne of the functions of the WNT signalling pathway is to balance two important One of the functions of the WNT signalling pathway is to balance two importantOne of the functions of the WNT signalling pathway is to balance two important One of the functions of the WNT signalling pathway is to balance\nprocesses in cells: cell division (\u201cproliferation\u201d) and cell specialization processesprocesses in cells: cell processes cellcells: (\u201cproliferation\u201d)(\u201cproliferation\u201d) andand cellcell specializationspecialization\ndivisiondivision c\nin\ncells: in\n(\u201cdifferentiation\u201d). By correctly balancing these, the body will have enough cells \u2013 (\u201cdifferentiation\u201d). By correctly balancing these, the body will have enough cells \u2013(\u201cdifferentiation\u201d). By correctly balancing these, the body will have enough cells \u2013\nnot too few or too many \u2013 and those cells will be of the right type, doing their rightnot too few or too many \u2013 and those cells will be of the right type, doing their rightnot too few or too many \u2013 and those cells will be of the right type, doing their rightnot too few or too many \u2013 & &\nfunction. If any of these processes get disrupted, this can lead to diseases. The most function. If any of these processes get disrupted, this can lead to diseases. The mostfunction. If any of these processes get disrupted, this can lead to diseases. The most function. If any of these pro\nprominent example is cancer, in which cell division gets out of control. prominent example is cancer, in which cell division gets out of control.prominent example is cancer, in which cell division gets out of control. prominent example is cancer, in which cell division gets out of control.\nThis WNT signalling pathway is very complex: both the mouse and human DNA This WNT signalling pathway is very complex: both the mouse and human DNAThis WNT signalling pathway is very complex: both the mouse and human DNA\ncontains 19 different genes encoding 19 different WNT proteins. Different cell types contains 19 different genes encoding 19 different WNT proteins. Different cell typescontains 19 different genes encoding 19 different WNT proteins. Different cell types\nin the body express different sets of WNT genes. To add to that, dozens of other in the body express different sets of WNT genes. To add to that, dozens of otherin the body express different sets of WNT genes. To add to that, dozens of other in the body express different sets of WNT\nproteins are involved in the WNT signalling pathway. They interact with the WNT proteins are involved in the WNT signalling pathway. They interact with the WNTproteins are involved in the WNT signalling pathway. They interact with the WNT\n\nAddendum\n\nproteins during the receiving or transmission of signals in the cell. Because of this\ncomplexity, after nearly 40 years of research on this pathway, there are still major\ngaps in our knowledge of the exact interactions happening in the cell when a WNT\nprotein comes by on the outside.\nIn this thesis, we have developed novel experimental tools to help visualize and\ntrack how WNT signalling controls development and homeostasis, and what\nmechanisms and interactions happen in cells that receive WNT signals.\n\nTissues are complex 3D environments, consisting of different cell types that all have\ntheir specialized function. Breast tissue is no exception: it contains fat cells, cells\nforming the milk ducts, the milk glands and all kinds of support cell types as well.\nWe know that WNT signalling is important for the development and homeostasis of\nbreast tissue, but we also know that changes in WNT gene expression are difficult to\nmeasure in all of these different cell types, since they are often subtle. Therefore, very\nsensitive techniques are needed to detect these subtle changes. Since we cannot\ndirectly study these processes in humans, we make use of the mouse as mammalian\nmodel organism. In chapter 2, we use a technique called qRT-PCR for studying\nsubtle gene expression changes during different developmental stages of the breast\n(also called mammary gland). To accurately quantify the subtle gene expression\nchanges that occur during tissue development, normalization of the data is required\nusing so-called reference genes. However, it turned out that the traditionally used\nones were not sufficient. We therefore used large published gene expression datasets\nto identify novel reference genes and tested and validated these for qRT-PCR studies\nof the developing mouse mammary gland. Using the new reference genes Prdx1, Phf7\nand Ctbp1, we are able to more reliably detect subtle WNT gene changes between\ndifferent mammary gland developmental timepoints.\n\nThe mouse mammary gland grows out during puberty, but in the adult the\ntissue remains remarkably dynamic. Like in every other tissue, maintenance is an\nactive process where new cells replace old or damaged cells. On top of that, in the\nmammary gland, every reproductive cycle, the ducts meant to transport milk prepare\nthemselves by building extra side ducts in the case a pregnancy happens. When that\ndoesn\u2019t occur, they regress again. The same thing happens during the menstrual\ncycle in humans, but in mice this cycle is only 4-5 days, so you can imagine this needs\na lot of controlled cell growth. Specialized cells, called mammary stem cells, are\nresponsible for producing the cells forming these ducts.\nWe want to know where these stem cells are located and how exactly they\ncontribute to cell turnover and homeostasis of the mammary gland tissue. In\nchapter 3 we describe a method to carry out such an investigation in intact mouse\nmammary glands. The method is called lineage tracing, and it allows us to label cells\nand follow exactly where they are and what their line of progeny is (hence the term\n\nlineage). We discuss the pros and cons of two different genetic labelling techniques\nto perform lineage tracing of mammary stem cells: one using Cre ERT2 \/LoxP, the other\nrtTA\/TeO-Cre\/LoxP and point out the critical steps in designing and executing such\nexperiments.\nLineage tracing is possible via the use of genetically engineered mouse models.\nOne mouse must carry a so-called \u201cdriver gene\u201d as well as a \u201creporter gene\u201d in the\ngenome. The driver consists of a gene expressed in a specific cell-type (such as a stem\ncell) and the resulting protein encoded by that gene can in turn switch on the reporter\ngene, but only when a drug is given to the mouse, allowing us to control at with\ntimepoint we switch on the reporter gene in a stem cell. This process is similar to\nflicking on a light switch in a dark room, with the difference that once this reporter\nis switched on, it will be switched on forever and permanently label the cell.\nMoreover, when the cell divides all daughter cells inherit it. In this way, we can track\nwhich cells are the progeny of the stem cell that was initially labelled. The label often\nused is a fluorescent protein. With the help of microscopes, we can literally make the\ncells carrying fluorescent proteins light up and visualize where they are in a tissue.\n\nSeveral lineage tracing mouse models exist. However, we noticed that the current\ndriver lines were not perfect for studying stem cells in the mammary gland.\nTherefore, in chapter 4 we describe the generation of a novel genetic mouse model\n(its full name being Axin2 P2A-rtTA3-T2A-3xNLS-SGFP2 ) that has a double function: it serves\nas a driver line for lineage tracing, but also as a live fluorescent reporter for WNT-\nresponsive stem cells (most stem cells found in adult tissues are receiving WNT\nsignals, we call those cells \u201cWNT-responsive\u201d). This double function allows us to\nvisualize the current stem cells (they will be labelled with a live, bright green\nfluorescent reporter) and at the same time visualize their lineage (once we cross this\ndriver to a suitable reporter mouse line). This double function was not available yet\nfor the WNT signalling target gene Axin2, which is expressed in most adult stem cells\nresponding to WNT. We show that this novel mouse model faithfully reports WNT\nsignalling activity during development and in different tissues, and that we can use\nit as a proper driver line for lineage tracing as well.\n\nTo further improve our lineage tracing toolbox, in chapter 5 we describe the\ngeneration and analysis of a novel lineage tracing reporter (named Rosa26 PRIME ).\nThis reporter cannot express just one, but four different fluorescent proteins, & &\nallowing more resolution when tracing the lineage of cells because we can distinguish\ncell lineages carrying different colours (red, cyan and yellow). It also expresses a far-\nred fluorescent protein in all non-labelled cells, allowing easy visualization of whole\ntissues. This novel reporter aims to be better and brighter than previously existing\nmouse models, although we did not yet manage to test this in a living organism (in\nvivo).\n\nAddendum\n\nCreating genetically engineered mouse models is a long and challenging process. But\nrecently, the emergence of the CRISPR\/Cas9 genome editing technique promised\nthat this could become easier. In chapter 6 we therefore set out to create a toolbox\nfor CRISPR\/Cas9 genome editing, first starting in human and mouse cell lines and\nultimately in mice. We focused on a very important protein in the WNT signalling\npathway that is central to most of the signalling events: beta-catenin (with the gene\nname being Ctnnb1). We show that we can successfully edit the Ctnnb1 gene in cells:\nwe can not only cut it up (an destroy it), but we can also modify it with high precision,\nso that it becomes labelled with a fluorescent protein. After that, we optimized\nCRISPR\/Cas9 genome editing to specifically insert a gene encoding for a fluorescent\nprotein into the Ctnnb1 gene in mouse embryos, creating precision engineered\nknock-in mice. The resulting mice carry a fusion of the fluorescent protein with beta-\ncatenin. This allows us to image the localization of this protein in cells and tissues\nand study what it is doing in live cells for the first time.\n\nOverall, this thesis describes the generation of several novel tools to study WNT\nsignalling at physiological levels in mice. Together they provide a strong basis for\nfuture generations of scientists to unravel the mechanisms of WNT signalling and its\nimpact on development, tissue homeostasis and disease.","auteur":"Anoeska Van De Moosdijk","auteur_slug":"anoeska-van-de-moosdijk","publicatiedatum":"16 november 2021","taal":"EN","url_flipbook":"https:\/\/ebook.proefschriftmaken.nl\/ebook\/anoeskavandemoosdijk?iframe=true","url_download_pdf":"","url_epub":"","ordernummer":"FTP-202603191254","isbn":"978-94-6423-474-9","doi_nummer":"","naam_universiteit":"Universiteit van Amsterdam","afbeeldingen":7985,"video_url":"","podcast_url":"","naam_student:":"","binnenwerk":"","universiteit":"Universiteit van Amsterdam","cover":"","afwerking":"","cover_afwerking":"","design":""},"_links":{"self":[{"href":"https:\/\/www.proefschriftmaken.nl\/en\/wp-json\/wp\/v2\/us_portfolio\/14448","targetHints":{"allow":["GET"]}}],"collection":[{"href":"https:\/\/www.proefschriftmaken.nl\/en\/wp-json\/wp\/v2\/us_portfolio"}],"about":[{"href":"https:\/\/www.proefschriftmaken.nl\/en\/wp-json\/wp\/v2\/types\/us_portfolio"}],"wp:featuredmedia":[{"embeddable":true,"href":"https:\/\/www.proefschriftmaken.nl\/en\/wp-json\/wp\/v2\/media\/7985"}],"wp:attachment":[{"href":"https:\/\/www.proefschriftmaken.nl\/en\/wp-json\/wp\/v2\/media?parent=14448"}],"wp:term":[{"taxonomy":"university_us_portfolio","embeddable":true,"href":"https:\/\/www.proefschriftmaken.nl\/en\/wp-json\/wp\/v2\/university_us_portfolio?post=14448"}],"curies":[{"name":"wp","href":"https:\/\/api.w.org\/{rel}","templated":true}]}}