{"id":11881,"date":"2026-04-21T12:31:20","date_gmt":"2026-04-21T12:31:20","guid":{"rendered":"https:\/\/www.proefschriftmaken.nl\/portfolio\/liu-sun\/"},"modified":"2026-04-21T12:31:26","modified_gmt":"2026-04-21T12:31:26","slug":"liu-sun","status":"publish","type":"us_portfolio","link":"https:\/\/www.proefschriftmaken.nl\/en\/portfolio\/liu-sun\/","title":{"rendered":"Liu Sun"},"content":{"rendered":"","protected":true},"excerpt":{"rendered":"","protected":true},"author":7,"featured_media":11882,"comment_status":"closed","ping_status":"closed","template":"","meta":{"_acf_changed":false,"footnotes":""},"us_portfolio_category":[45],"class_list":["post-11881","us_portfolio","type-us_portfolio","status-publish","post-password-required","hentry","us_portfolio_category-new-template"],"acf":{"naam_van_het_proefschift":"Deciphering PLN-R14del Cardiomyopathy","samenvatting":"Cardiomyopathie\u00ebn vormen een heterogene groep aandoeningen van de hartspier die worden gekenmerkt door structurele en\/of functionele afwijkingen van het hart. Deze afwijkingen kunnen leiden tot progressieve contractiestoornissen, hartritmestoornissen, hartfalen en plotselinge hartdood. Een belangrijk deel van deze aandoeningen heeft een genetische oorzaak. Binnen deze groep neemt phospholamban (PLN)-gerelateerde cardiomyopathie een voorname plaats in. In het bijzonder is de pathogene variant PLN-R14del van groot klinisch belang, omdat deze in Nederland relatief frequent voorkomt en gepaard gaat met een verhoogd risico op zowel aritmogene als gedilateerde cardiomyopathie. De klinische expressie is echter sterk variabel: sommige dragers ontwikkelen al op jonge leeftijd ernstige ziekte, terwijl anderen pas laat of slechts in milde vorm symptomen krijgen. Deze heterogeniteit wijst erop dat de pathogenese van PLN-R14del-cardiomyopathie complex is en niet volledig kan worden verklaard vanuit \u00e9\u00e9n enkel mechanisme.\n\nPLN is een klein regulatoir membraaneiwit dat in hartspiercellen de activiteit van de calcium pomp SERCA2a in het sarco(endo)plasmatisch reticulum (SR\/ER) moduleert en daarmee de calcium opname vanuit het cytoplasma naar het SR\/ER be\u00efnvloedt. Lange tijd werd aangenomen dat de ziekte vooral het gevolg was van een verstoorde calciumhuishouding door afwijkende remming van SERCA2a door PLN. Recente resultaten, waaronder die in dit proefschrift, laten echter zien dat deze klassieke verklaring onvoldoende is. In plaats daarvan wijzen de experimentele en conceptuele bevindingen op een breder ziektebeeld, waarin verstoring van SR\/ER-structuur, afwijkende eiwitorganisatie, ontregeling van proteostase en mutatie-specifieke cellulaire stressresponsen centraal staan. Daarmee verschuift het perspectief van een louter calcium-geori\u00ebnteerd model naar een model waarin structurele en proteotoxische processen een doorslaggevende rol spelen in het ontstaan van ziekte.\n\nIn dit proefschrift stond daarom de vraag centraal welke moleculaire en pathofysiologische mechanismen ten grondslag liggen aan PLN-R14del-cardiomyopathie, en in hoeverre deze mechanismen aanknopingspunten bieden voor gerichte therapie. Hiertoe zijn vijf samenhangende onderzoekslijnen uitgewerkt: 1) een overzicht van klinisch beschreven PLN-varianten en hun vermoedelijke werkingsmechanismen; 2) een analyse van cardiale stress als mogelijke ziektemodifier; 3) de ontwikkeling van een induceerbaar muismodel om vroege ziekteprocessen te bestuderen; 4) een evaluatie van dosisafhankelijke effecten van PLN-gerichte antisense oligonucleotiden (ASO\u2019s); 5) een in silico-analyse van de gevolgen van PLN-silencing voor verschillende PLN-complexen.\n\nHet overzicht van bekende pathogene PLN-varianten in hoofdstuk 2, laat zien dat PLN-gerelateerde cardiomyopathie niet kan worden beschouwd als \u00e9\u00e9n uniforme aandoening. Verschillende varianten, waaronder truncaties, missense-mutaties en deleties zoals R14del, R9C, R9H, R9L en L39stop, leiden tot uiteenlopende fenotypes en waarschijnlijk ook tot verschillende onderliggende moleculaire defecten. De verschillen betreffen onder meer oligomerisatie, fosforylering, membraaninsertie, stabiliteit en eiwit-eiwitinteracties. Deze bevindingen onderstrepen dat niet alle PLN-varianten via hetzelfde mechanisme pathogeen zijn, en dat een uniforme therapeutische benadering waarschijnlijk niet voor alle dragers optimaal zal zijn. Dit heeft belangrijke implicaties voor toekomstige precisiegeneeskunde binnen het veld van erfelijke cardiomyopathie\u00ebn.\n\nVervolgens is in hoofdstuk 3 onderzocht of verhoogde cardiale belasting het ontstaan van PLN-R14del-cardiomyopathie kan versnellen. Omdat dragers een sterke variatie vertonen in leeftijd van ziekte-onset en ernst, werd verondersteld dat bijkomende stressoren de drempel voor ziekteactivatie mogelijk kunnen verlagen. In een heterozygoot PLN-R14del-muismodel werd hiervoor drukbelasting ge\u00efnduceerd met transverse aorta constrictie (TAC). Hoewel TAC, zoals verwacht, leidde tot hypertrofie, fibrose en afname van de cardiale functie, veroorzaakte het geen versnelde vorming van de kenmerkende PLN-positieve SR\/ER-clusters en ook geen extra mutatie-specifieke verslechtering bovenop de algemene respons op drukbelasting. Deze resultaten laten zien dat acute biomechanische belasting op zichzelf onvoldoende is om het specifieke ziekteproces van PLN-R14del te initi\u00ebren of te versnellen. Daarmee lijkt algemene cardiale stress niet een simpele verklaring voor de klinische heterogeniteit bij dragers te zijn.\n\nOm de vroegste gebeurtenissen in het ziekteproces beter te kunnen bestuderen, werd in dit proefschrift een nieuw induceerbaar PLN-R14del-muismodel ontwikkeld, zoals beschreven in hoofdstuk 4. In dit model kon de expressie van wildtype PLN in volwassen cardiomyocyten synchroon worden omgezet naar expressie van PLN-R14del door middel van een tamoxifen-afhankelijke MerCreMer\/LoxP-strategie. Hierdoor werd het mogelijk om ziekte-initiatie in de tijd gecontroleerd te volgen, zonder verstoring door ontwikkelingsprocessen of asynchrone expressie. Met dit model werd aangetoond dat de eerste detecteerbare afwijking bestaat uit het ontstaan van kleine PLN-positieve clusters in het SR\/ER, die in de loop van de tijd uitgroeien tot de karakteristieke perinucleaire structuren die kenmerkend zijn voor deze cardiomyopathie. Belangrijk is dat deze structurele veranderingen al zichtbaar waren voordat duidelijke functionele achteruitgang of uitgesproken weefselafwijkingen optraden. Dit wijst erop dat SR\/ER-misvorming een vroege en waarschijnlijk primaire gebeurtenis is in de pathogenese van PLN-R14del-cardiomyopathie.\n\nAanvullende transcriptoom en proteoom analyses van ge\u00efsoleerde cardiomyocyten uit dit induceerbare model lieten zien dat de vroege moleculaire veranderingen zich vooral op eiwitniveau manifesteren. Terwijl op mRNA-niveau relatief weinig veranderingen werden waargenomen, toonde het proteoom duidelijke verstoringen in SR\/ER-gerelateerde processen. Daarbij werden onder meer veranderingen gevonden die passen bij activering of overbelasting van kwaliteitscontrolemechanismen in het endoplasmatisch reticulum, inclusief accumulatie van eiwitten die verband houden met ER-geassocieerde afbraak (ERAD). Ook werd een discrepantie zichtbaar tussen transcriptie en eiwitexpressie, wat wijst op een belangrijke rol voor post-translationele en\/of afbraak-gerelateerde regulatie. Samen ondersteunen deze bevindingen het concept dat PLN-R14del-cardiomyopathie vroeg wordt gekenmerkt door verstoorde proteostase en een ontregeld intracellulair kwaliteitscontrolesysteem, gevolgd door latere transcriptoom veranderingen.\n\nEen volgende centrale vraag was hoe verlaging van PLN-expressie therapeutisch ingrijpt op dit ziekteproces. In een homozygoot PLN-R14del-muismodel werd daarom het effect van verschillende doseringen van PLN-gerichte antisense oligonucleotiden onderzocht, zoals beschreven in hoofdstuk 5. Deze experimenten toonden een duidelijke dosisafhankelijke bescherming: ASO-behandeling leidde tot verbetering van de cardiale functie, afname van remodellering, verlenging van de overleving en reductie van de pathologische PLN-positieve SR-clusters. Opvallend was echter dat de invloed op calciumdynamiek in mutante hartspiercellen beperkt bleef. In wildtype-cellen leidde PLN-depletie wel tot de verwachte versnelling van calcium- en contractiedynamiek, maar in PLN-R14del-hartspiercellen waren deze parameters reeds versneld en nauwelijks verder te verbeteren. Dit ondersteunt de conclusie dat het therapeutisch effect van PLN-ASO bij deze mutatie niet primair berust op herstel van calciumregulatie, maar vooral op herstel van SR-structuur.\n\nOm beter te begrijpen waarom PLN-silencing vooral de structurele pathologie lijkt te be\u00efnvloeden, is in hoofdstuk 6 aanvullend een in silico-model ontwikkeld waarin verschillende moleculaire vormen van PLN werden gesimuleerd: vrije monomeren, pentameren en SERCA-gebonden complexen. Deze simulaties lieten zien dat pentamere PLN-complexen gevoeliger zijn voor afname van totale PLN-concentratie dan vrije of SERCA-gebonden PLN-vormen. Dat is relevant, omdat juist de pentameer of geclusterde PLN-pool vermoedelijk sterk bijdraagt aan de abnormale intracellulaire accumulatie die bij PLN-R14del wordt gezien. De modelresultaten bieden daarmee een mechanistische verklaring voor de experimentele observatie dat PLN-silencing gepaard gaat met afname van abnormale clustering en herstel van SR-architectuur, terwijl de functionele SERCA-gerelateerde pool relatief langer behouden blijft. Deze bevindingen ondersteunen het idee dat niet alle PLN-pools even gevoelig zijn voor afname van totale PLN-concentratie en dat de pentameer vorm, die het gevoeligst reageert, wellicht de meest pathologische component van het systeem is.\n\nGezamenlijk geven de resultaten in dit proefschrift aanleiding tot een herijking van het ziekteconcept van PLN-R14del-cardiomyopathie. In plaats van een aandoening die hoofdzakelijk wordt gedreven door afwijkende calciumremming van SERCA2a, komt er een beeld naar voren van een structurele proteinopathie van het sarco(endo)plasmatisch reticulum. Een centrale vroege gebeurtenis is de vorming van afwijkende PLN-positieve SR\/ER-clusters, gevolgd door ontregeling van proteostase, activatie van intracellulaire stressroutes en uiteindelijk progressieve cardiale remodellering en functieverlies. Deze interpretatie verbindt de histologische, moleculaire, functionele en therapeutische bevindingen binnen dit proefschrift tot \u00e9\u00e9n samenhangend geheel.\n\nDe resultaten hebben daarnaast duidelijke translationele implicaties. Ten eerste ondersteunen zij verdere ontwikkeling van PLN-gerichte silencingstrategie\u00ebn als veelbelovende therapeutische route, waarbij optimaliseren van de juiste dosering in de mens een belangrijk aandachtspunt zal zijn. Ten tweede benadrukken onze resultaten het belang van vroege detectie, omdat interventie v\u00f3\u00f3r het ontstaan van irreversibele structurele schade waarschijnlijk het meest effectief zal zijn. Ten derde suggereren zij dat toekomstige biomarkerontwikkeling zich niet uitsluitend moet richten op globale hartfunctiemetingen, maar ook op vroege indicatoren van SR\/ER-stress. Tot slot hebben we beschreven dat er PLN-variant-specifieke verschillen in onderliggend pathologische mechanismen kunnen zijn. Hiermee dient rekening te worden gehouden bij de ontwikkeling van nieuwe therapie\u00ebn.\n\nSamenvattend toont dit proefschrift aan dat de pathogene variant PLN-R14del leidt tot een vroeg optredende ontregeling van de intracellulaire SR\/ER-organisatie, met daaropvolgende verstoring van proteostase en progressieve achteruitgang van hartspiercel functie. De bevindingen verschuiven het pathogenetische paradigma van een overwegend calcium-geori\u00ebnteerde verklaring naar een model waarin structurele ontregeling en abnormale eiwitorganisatie centraal staan. Daarmee levert dit proefschrift niet alleen nieuwe inzichten in de biologie van PLN-R14del-cardiomyopathie, maar ook een basis voor de verdere ontwikkeling van mechanisme-gedreven en mutatie-specifieke behandelstrategie\u00ebn.","summary":"Cardiomyopathies constitute a heterogeneous group of myocardial disorders characterized by structural and\/or functional abnormalities of the heart. These abnormalities can lead to progressive contractile dysfunction, arrhythmias, heart failure, and sudden cardiac death. A significant portion of these conditions has a genetic cause. Within this group, phospholamban (PLN)-related cardiomyopathy holds a prominent place. In particular, the pathogenic PLN-R14del variant is of great clinical importance, as it occurs relatively frequently in the Netherlands and is associated with an increased risk of both arrhythmogenic and dilated cardiomyopathy. However, clinical expression is highly variable: some carriers develop severe disease at a young age, while others develop symptoms late or only in a mild form. This heterogeneity indicates that the pathogenesis of PLN-R14del cardiomyopathy is complex and cannot be fully explained by a single mechanism.\n\nPLN is a small regulatory membrane protein that modulates the activity of the calcium pump SERCA2a in the sarco(endo)plasmic reticulum (SR\/ER) in cardiac muscle cells, thereby influencing calcium uptake from the cytoplasm into the SR\/ER. For a long time, it was assumed that the disease was primarily the result of disturbed calcium homeostasis due to abnormal inhibition of SERCA2a by PLN. However, recent results, including those in this thesis, show that this classic explanation is insufficient. Instead, experimental and conceptual findings point to a broader clinical picture in which disruption of SR\/ER structure, abnormal protein organization, dysregulation of proteostasis, and mutation-specific cellular stress responses are central. This shifts the perspective from a purely calcium-oriented model to a model in which structural and proteotoxic processes play a decisive role in the development of the disease.\n\nThe central question in this thesis was therefore which molecular and pathophysiological mechanisms underlie PLN-R14del cardiomyopathy, and to what extent these mechanisms offer points of contact for targeted therapy. To this end, five coherent lines of research have been developed: 1) an overview of clinically described PLN variants and their suspected mechanisms of action; 2) an analysis of cardiac stress as a possible disease modifier; 3) the development of an inducible mouse model to study early disease processes; 4) an evaluation of dose-dependent effects of PLN-targeted antisense oligonucleotides (ASOs); 5) an in silico analysis of the consequences of PLN silencing for different PLN complexes.\n\nThe overview of known pathogenic PLN variants in Chapter 2 shows that PLN-related cardiomyopathy cannot be considered a single uniform condition. Different variants, including truncations, missense mutations, and deletions such as R14del, R9C, R9H, R9L, and L39stop, lead to diverse phenotypes and probably also to different underlying molecular defects. The differences concern, among other things, oligomerization, phosphorylation, membrane insertion, stability, and protein-protein interactions. These findings underscore that not all PLN variants are pathogenic via the same mechanism, and that a uniform therapeutic approach will probably not be optimal for all carriers. This has important implications for future precision medicine within the field of inherited cardiomyopathies.\n\nSubsequently, Chapter 3 investigated whether increased cardiac load can accelerate the onset of PLN-R14del cardiomyopathy. Since carriers show a strong variation in the age of disease onset and severity, it was hypothesized that additional stressors could potentially lower the threshold for disease activation. In a heterozygous PLN-R14del mouse model, pressure overload was induced for this purpose with transverse aortic constriction (TAC). Although TAC, as expected, led to hypertrophy, fibrosis, and a decrease in cardiac function, it did not cause accelerated formation of the characteristic PLN-positive SR\/ER clusters, nor any additional mutation-specific worsening on top of the general response to pressure overload. These results show that acute biomechanical stress in itself is insufficient to initiate or accelerate the specific disease process of PLN-R14del. Thus, general cardiac stress does not appear to be a simple explanation for the clinical heterogeneity in carriers.\n\nTo better study the earliest events in the disease process, a new inducible PLN-R14del mouse model was developed in this thesis, as described in Chapter 4. In this model, the expression of wild-type PLN in adult cardiomyocytes could be synchronously converted to the expression of PLN-R14del by means of a tamoxifen-dependent MerCreMer\/LoxP strategy. This made it possible to monitor disease initiation in a time-controlled manner, without interference from developmental processes or asynchronous expression. Using this model, it was demonstrated that the first detectable abnormality consists of the appearance of small PLN-positive clusters in the SR\/ER, which over time grow into the characteristic perinuclear structures that are hallmark of this cardiomyopathy. Importantly, these structural changes were already visible before clear functional decline or pronounced tissue abnormalities occurred. This suggests that SR\/ER malformation is an early and probably primary event in the pathogenesis of PLN-R14del cardiomyopathy.\n\nAdditional transcriptome and proteome analyses of isolated cardiomyocytes from this inducible model showed that early molecular changes manifest themselves mainly at the protein level. While relatively few changes were observed at the mRNA level, the proteome showed clear disruptions in SR\/ER-related processes. Changes were found that match activation or overload of quality control mechanisms in the endoplasmic reticulum, including accumulation of proteins related to ER-associated degradation (ERAD). A discrepancy was also visible between transcription and protein expression, suggesting an important role for post-translational and\/or degradation-related regulation. Together, these findings support the concept that PLN-R14del cardiomyopathy is characterized early on by disturbed proteostasis and a dysregulated intracellular quality control system, followed by later transcriptome changes.\n\nA next central question was how reduction of PLN expression intervenes therapeutically in this disease process. In a homozygous PLN-R14del mouse model, the effect of different doses of PLN-targeted antisense oligonucleotides was therefore investigated, as described in Chapter 5. These experiments showed a clear dose-dependent protection: ASO treatment led to improvement in cardiac function, reduction in remodeling, extension of survival, and reduction of the pathological PLN-positive SR clusters. Strikingly, however, the influence on calcium dynamics in mutant heart muscle cells remained limited. In wild-type cells, PLN depletion did lead to the expected acceleration of calcium and contractile dynamics, but in PLN-R14del heart muscle cells these parameters were already accelerated and could hardly be improved further. This supports the conclusion that the therapeutic effect of PLN-ASO in this mutation is not primarily based on restoration of calcium regulation, but mainly on restoration of SR structure.\n\nTo better understand why PLN silencing primarily seems to affect the structural pathology, an additional in silico model was developed in Chapter 6 in which different molecular forms of PLN were simulated: free monomers, pentamers, and SERCA-bound complexes. These simulations showed that pentameric PLN complexes are more sensitive to a decrease in total PLN concentration than free or SERCA-bound PLN forms. This is relevant because the pentamer or clustered PLN pool presumably contributes strongly to the abnormal intracellular accumulation seen in PLN-R14del. The model results thus provide a mechanistic explanation for the experimental observation that PLN silencing is accompanied by a decrease in abnormal clustering and restoration of SR architecture, while the functional SERCA-related pool remains relatively longer preserved. These findings support the idea that not all PLN pools are equally sensitive to a decrease in total PLN concentration and that the pentamer form, which responds most sensitively, is perhaps the most pathological component of the system.\n\nTaken together, the results in this thesis call for a recalibration of the disease concept of PLN-R14del cardiomyopathy. Instead of a condition driven primarily by abnormal calcium inhibition of SERCA2a, a picture emerges of a structural proteinopathy of the sarco(endo)plasmic reticulum. A central early event is the formation of abnormal PLN-positive SR\/ER clusters, followed by dysregulation of proteostasis, activation of intracellular stress pathways, and ultimately progressive cardiac remodeling and loss of function. This interpretation connects the histological, molecular, functional, and therapeutic findings within this thesis into one coherent whole.\n\nThe results also have clear translational implications. First, they support the further development of PLN-targeted silencing strategies as a promising therapeutic route, where optimizing the correct dosage in humans will be an important point of attention. Second, our results emphasize the importance of early detection, as intervention before irreversible structural damage occurs will probably be most effective. Third, they suggest that future biomarker development should not focus exclusively on global cardiac function measurements, but also on early indicators of SR\/ER stress. Finally, we have described that there may be PLN-variant-specific differences in underlying pathological mechanisms. This must be taken into account in the development of new therapies.\n\nIn summary, this thesis demonstrates that the pathogenic PLN-R14del variant leads to an early onset dysregulation of intracellular SR\/ER organization, with subsequent disruption of proteostasis and progressive decline in cardiomyocyte function. The findings shift the pathogenetic paradigm from a predominantly calcium-oriented explanation to a model in which structural dysregulation and abnormal protein organization are central. Thus, this thesis provides not only new insights into the biology of PLN-R14del cardiomyopathy, but also a basis for the further development of mechanism-driven and mutation-specific treatment strategies.","auteur":"Liu Sun","auteur_slug":"liu-sun","publicatiedatum":"27 mei 2026","taal":"NL","url_flipbook":"https:\/\/ebook.proefschriftmaken.nl\/ebook\/liusun?iframe=true","url_download_pdf":"https:\/\/ebook.proefschriftmaken.nl\/download\/453e9a3a-bc11-42c3-867d-dad701edaad7\/optimized","url_epub":"","ordernummer":"18907","isbn":"","doi_nummer":"","naam_universiteit":"Rijksuniversiteit Groningen","afbeeldingen":11883,"naam_student:":"","binnenwerk":"","universiteit":"Rijksuniversiteit Groningen","cover":"","afwerking":"","cover_afwerking":"","design":""},"_links":{"self":[{"href":"https:\/\/www.proefschriftmaken.nl\/en\/wp-json\/wp\/v2\/us_portfolio\/11881","targetHints":{"allow":["GET"]}}],"collection":[{"href":"https:\/\/www.proefschriftmaken.nl\/en\/wp-json\/wp\/v2\/us_portfolio"}],"about":[{"href":"https:\/\/www.proefschriftmaken.nl\/en\/wp-json\/wp\/v2\/types\/us_portfolio"}],"author":[{"embeddable":true,"href":"https:\/\/www.proefschriftmaken.nl\/en\/wp-json\/wp\/v2\/users\/7"}],"replies":[{"embeddable":true,"href":"https:\/\/www.proefschriftmaken.nl\/en\/wp-json\/wp\/v2\/comments?post=11881"}],"version-history":[{"count":1,"href":"https:\/\/www.proefschriftmaken.nl\/en\/wp-json\/wp\/v2\/us_portfolio\/11881\/revisions"}],"predecessor-version":[{"id":11884,"href":"https:\/\/www.proefschriftmaken.nl\/en\/wp-json\/wp\/v2\/us_portfolio\/11881\/revisions\/11884"}],"wp:featuredmedia":[{"embeddable":true,"href":"https:\/\/www.proefschriftmaken.nl\/en\/wp-json\/wp\/v2\/media\/11882"}],"wp:attachment":[{"href":"https:\/\/www.proefschriftmaken.nl\/en\/wp-json\/wp\/v2\/media?parent=11881"}],"wp:term":[{"taxonomy":"us_portfolio_category","embeddable":true,"href":"https:\/\/www.proefschriftmaken.nl\/en\/wp-json\/wp\/v2\/us_portfolio_category?post=11881"}],"curies":[{"name":"wp","href":"https:\/\/api.w.org\/{rel}","templated":true}]}}