{"id":11029,"date":"2026-04-10T10:28:36","date_gmt":"2026-04-10T10:28:36","guid":{"rendered":"https:\/\/www.proefschriftmaken.nl\/portfolio\/tamara-van-gorkom\/"},"modified":"2026-04-22T14:59:32","modified_gmt":"2026-04-22T14:59:32","slug":"tamara-van-gorkom","status":"publish","type":"us_portfolio","link":"https:\/\/www.proefschriftmaken.nl\/en\/portfolio\/tamara-van-gorkom\/","title":{"rendered":"Tamara Van Gorkom"},"content":{"rendered":"","protected":false},"excerpt":{"rendered":"","protected":false},"author":8,"featured_media":12328,"comment_status":"closed","ping_status":"closed","template":"","meta":{"_acf_changed":false,"footnotes":""},"us_portfolio_category":[45],"class_list":["post-11029","us_portfolio","type-us_portfolio","status-publish","has-post-thumbnail","hentry","us_portfolio_category-new-template"],"acf":{"naam_van_het_proefschift":"IMMUNODIAGNOSTICS OF LYME NEUROBORRELIOSIS","samenvatting":"De ziekte van Lyme wordt veroorzaakt door spiraalvormige bacteri\u00ebn, zogenaamde spirocheten, die onderdeel zijn van de Borrelia burgdorferi sensu lato (s.l.)-groep [1]. De drie meest voorkomende Borrelia species in Europa zijn: Borrelia afzelii, Borrelia garinii en Borrelia burgdorferi sensu stricto (s.s.), terwijl in Noord-Amerika met name B. burgdorferi s.s. voorkomt [2]. B. burgdorferi s.l. kan op de mens worden overgedragen door de beet van een met B. burgdorferi s.l. ge\u00efnfecteerde Ixodes-teek, welke met name voorkomt in gematigde gebieden op het Noordelijk halfrond [3]. Het meest voorkomende klinische beeld in de vroege fase van de infectie wordt gekarakteriseerd door een rode, zich langzaam uitbreidende huiduitslag, ook wel bekend als erythema migrans (EM) [2]. Indien onbehandeld, kan B. burgdorferi s.l. zich door het lichaam verspreiden, met name naar de gewrichten (Lyme artritis), het zenuwstelsel (Lyme neuroborreliose [LNB]), het hart (Lyme carditis) en\/of naar andere locaties op de huid (acrodermatitis chronica atrophicans) [2].\n\nDe diagnostiek van de ziekte van Lyme richt zich in eerste instantie op de aanwezigheid van klinische symptomen. Het klassieke EM beeld is in principe voldoende om de diagnose te stellen [4, 5]. Is het huidbeeld onduidelijk, of is er sprake van een andere manifestatie van de ziekte van Lyme, dan zijn laboratoriumtesten nodig om de diagnose te kunnen stellen [4, 5]. Deze laboratoriumtesten zijn gebaseerd op het direct of indirect aantonen van B. burgdorferi s.l. [6]. Voor het direct aantonen van B. burgdorferi s.l. kan gebruik worden gemaakt van microscopie, kweek of PCR, echter, omdat de bacterie vaak in lage aantallen aanwezig is in de mens, is de sensitiviteit van directe detectiemethoden vaak laag [6]. Uitzondering hierop is het gebruik van PCR op huidbiopten (bij symptomen die passen bij EM of acrodermatitis chronica atrophicans) of synoviaal vocht (bij symptomen die passen bij Lyme artritis) [6]. Het indirect aantonen van B. burgdorferi s.l. is gebaseerd op de reactie van het immuunsysteem op de bacterie, en dan met name op het aantonen van antistoffen [6].\n\nHet diagnosticeren van actieve Lymeziekte kan uitdagend zijn. Enerzijds zijn de symptomen vaak moeilijk te interpreteren en\/of niet Lyme-specifiek [4]. Daarnaast kan de interpretatie van laboratoriumtesten ingewikkeld zijn: een negatieve antistoftest hoeft geen bewijs te zijn voor de afwezigheid van actieve Lymeziekte, en een positieve antistoftest hoeft geen bewijs te zijn voor actieve Lymeziekte [7]. Vanwege deze diagnostische uitdagingen, richt het onderzoek in dit proefschrift zich op de vraag of de huidige diagnostiek van de ziekte van Lyme verbeterd kan worden en of er onderscheidt gemaakt kan worden tussen een actieve infectie en een in het verleden doorgemaakte infectie. Om deze vragen te kunnen beantwoorden zijn huidige en alternatieve diagnostische testen en\/of algoritmes ge\u00ebvalueerd, waaronder veelgebruikte diagnostische testen gebaseerd op de humorale immuunrespons (d.w.z., de detectie van Borrelia-specifieke antistoffen) en alternatieve diagnostische testen gebaseerd op de cellulaire immuunrespons (d.w.z., de detectie van bepaalde signaalstoffen geproduceerd door zogenaamde T cellen). Voor dit onderzoek is een studiepopulatie opgezet bestaande uit goed gedefinieerde pati\u00ebnten en controles.\n\nOmdat er duidelijke criteria bestaan voor het diagnosticeren van pati\u00ebnten met LNB, hebben we ons met name gericht op deze pati\u00ebntengroep. Pati\u00ebnten hebben LNB als ze voldoen aan ten minste twee van de volgende drie criteria, welke gesteld zijn door de Europese Federatie van Neurologische Verenigingen (European Federation of Neurological Societies [EFNS]) [8]:\n1. Aanwezigheid van neurologische symptomen wijzend op LNB zonder een duidelijke andere oorzaak\n2. Verhoogde cel aantallen in de liquor (\u22655 leukocyten\/\u03bcl liquor [pleiocytose])\n3. Intrathecale synthese van Borrelia-specifieke antistoffen\n\nVoldoet een pati\u00ebnt aan alle criteria, dan krijgt de pati\u00ebnt de classificatie \u2018definitieve LNB\u2019; voldoet een pati\u00ebnt aan twee van de drie criteria (waaronder in ieder geval de aanwezigheid van neurologische symptomen wijzend op LNB zonder een duidelijke andere oorzaak), dan krijgt de pati\u00ebnt de classificatie \u2018mogelijke LNB\u2019.\n\nDe detectie van intrathecaal geproduceerde Borrelia-specifieke antistoffen is dus van belang voor de diagnostiek van LNB. Er zijn echter veel verschillende antistoftesten op de markt en de prestatiekarakteristieken van veel van deze antistoftesten zijn vaak moeilijk te interpreteren vanwege de variabiliteit in studie-opzet, de heterogeniteit van de onderzochte studiepopulaties en de matige rapportage van gebruikte studiekarakteristieken [9]. Idealiter wordt er voor het bepalen van de prestatiekarakteristieken van testen gebruik gemaakt van een prospectieve cross-sectionele studie-opzet in een klinische setting waarin de test uiteindelijk ook gebruikt gaat worden. Desondanks worden er vaker \u2018case-control\u2019 (d.w.z., pati\u00ebnten versus controles) studies uitgevoerd, omdat deze makkelijker zijn uit te voeren [9]. Echter, dergelijke studies hebben wel een groter risico op gebiaste resultaten. Deze bias wordt verklaard doordat de onderzochte controlegroep vaak niet dezelfde klinische achtergrond heeft als de onderzochte pati\u00ebntengroep, waardoor de gevonden resultaten geen goede weergave geven van de werkelijkheid [9].\n\nDe belangrijkste bevinding van het onderzoek in dit proefschrift zijn de veelbelovende resultaten beschreven in hoofdstuk 6, omdat deze bevindingen artsen zullen helpen bij het diagnosticeren van LNB. In dit hoofdstuk zijn zeven antistoftesten voor de diagnostiek van LNB ge\u00ebvalueerd. Hierbij is gebruik gemaakt van een cross-sectionele studie-opzet, waarbij retrospectief alle opeenvolgende pati\u00ebnten van de afdeling neurologie zijn ge\u00efncludeerd, waarvan een liquor-serum paar was ingestuurd naar het medisch microbiologisch laboratorium van het Diakonessenhuis gedurende een bepaalde tijdsperiode. Tevens is er voor elke antistoftest een multiparameter analyse uitgevoerd om te onderzoeken of de prestatiekarakteristieken van de antistoftest verbeterd konden worden door het meenemen van extra parameters. Deze extra parameters betroffen een aantal routinematige liquor parameters (pleiocytose, totaal eiwit, bloed-liquor barri\u00e8re functionaliteit en intrathecale totale antistofsynthese), een Borrelia-specifieke (Borrelia species PCR) en een niet-specifieke liquor parameter (B-cel chemokine (C-X-C motief) ligand 13 [CXCL13]), en een Borrelia-specifieke serum parameter (Borrelia-specifieke antistoffen in het bloed). De resultaten van deze multiparameter analyses laten zien dat het gebruik van additionele parameters voor de diagnostiek van LNB in de meeste gevallen leidt tot een hogere sensitiviteit (vari\u00ebrend van 94,1% tot 100%) en een iets lagere specificiteit (vari\u00ebrend van 92,8% tot 96,4%) dan de sensitiviteit en specificiteit van de gevalideerde antistoftest zelf (vari\u00ebrend van 47,1% tot 100% en van 95,7% tot 100%, respectievelijk). De belangrijkste parameters die bijdragen aan een verbetering van de LNB diagnostiek zijn intrathecaal geproduceerde Borrelia-specifieke antistoffen, bloed-liquor barri\u00e8re functionaliteit, intrathecale totale antistofsynthese, pleiocytose, CXCL13 in de liquor, en Borrelia-specifieke antistoffen in het bloed. Alhoewel meerdere studies de toegevoegde waarde van deze parameters voor de diagnostiek van LNB laten zien [8, 10-12], is onze studie de eerste die de relatieve bijdrage van deze parameters laat zien. Tevens toont Onze studie aan welke parameters het meeste bijdragen en derhalve geschikt zijn om gebruikt te worden in een diagnostisch algoritme voor het aantonen van actieve LNB. Onze studie laat ook zien dat het meten van zowel de humorale als de cellulaire immuunrespons tegen een infectie met B. burgdorferi s.l. bijdraagt aan de diagnostiek van LNB, en dat individuele parameters (fout) negatief of (fout) positief kunnen zijn, maar toch een toegevoegde waarde hebben in breder verband. We zijn van mening dat deze resultaten dermate veelbelovend en belangrijk zijn dat een validatie met meerdere centra nodig is. We stellen daarom voor om, in samenwerking met andere (inter)nationale laboratoria, een prospectieve studie op te zetten om te onderzoeken of een gestandaardiseerd diagnostisch algoritme ontwikkeld kan worden voor de diagnostiek van LNB gebaseerd op een multiparameter analyse.\n\nDe resultaten van de multiparameter analyses in hoofdstuk 6 tonen aan dat van de onderzochte parameters, de detectie van intrathecaal geproduceerde Borrelia-specifieke antistoffen het meeste bijdraagt aan de diagnostiek van LNB. Voor de detectie van pathogeen-specifieke antistoffen wordt veelal gebruik gemaakt van een enzym-linked immunosorbent assay (ELISA) [4]. ELISAs kunnen echter last hebben van een zogenaamd \u2018randeffect\u2019 [13]. Er is sprake van een randeffect als het resultaat van de metingen van eenzelfde antistofconcentratie in welletjes in de randen van de ELISA plaat hoger (of lager) zijn dan de metingen in welletjes in het midden van de ELISA plaat. Wanneer er sprake is van een randeffect in een ELISA plaat, kan dit gevolgen hebben voor de pati\u00ebnten materialen die hierin getest worden. In hoofdstuk 5 is aangetoond dat er sprake is van een randeffect bij gebruik van de commerci\u00eble Enzygnost Lyme link VlsE\/ IgG ELISA. Er is tevens aangetoond dat bij gebruik van deze ELISA voor de diagnostiek van LNB, de gevolgen van dit randeffect verminderd kunnen worden door een kleine aanpassing in het standaardprotocol van de producent. Dit aangepaste protocol werd vervolgens gebruikt om 149 liquor-serumparen te testen, afkomstig van de iets grotere monstercollectie gebruikt in hoofdstuk 6 (en 4). Middels simulatie werd aangetoond dat als het standaardprotocol van de producent zou zijn gebruikt, het randeffect voor deze studiepopulatie in het slechtste scenario had kunnen resulteren in 15 (10,1%) fout-positieve en twee (1,3%) fout-negatieve Borrelia-specifieke immunoglobuline (Ig)G antistof index resultaten. Het aangetoonde randeffect kan dus leiden tot foutieve LNB diagnostiek. De onderzoeksresultaten in hoofdstuk 5 benadrukken het belang van een grondige validatie van ELISA testen voordat ze gebruikt worden voor routine diagnostiek, zoals bijvoorbeeld ook wordt vereist in de voorwaarden voor de ISO 15189-accreditatie [14].\n\nVoor de diagnostiek van de meeste andere Lyme manifestaties wordt gebruik gemaakt van de detectie van Borrelia-specifieke antistoffen in het bloed, waarvoor een twee-staps teststrategie wordt geadviseerd [5, 15]. Deze twee-staps teststrategie heeft tot doel de diagnostische prestaties van antistoftesten te verbeteren door te starten met een test met een hoge sensitiviteit (d.w.z., een screening test) en dubieuze en positieve test uitslagen verkregen met de screening test te confirmeren met een tweede (confirmatie) test met een hoge specificiteit [7, 16, 17]. Vaak wordt voor de screening test gebruik gemaakt van een ELISA en voor de confirmatietest van een western blot (Noord-Amerika) of een immunoblot (Europa) [7]. Antistoftesten kunnen vari\u00ebren in sensitiviteit, zoals is aangetoond in hoofdstuk 6, bijvoorbeeld doordat de antigenen in de test niet overeenkomen met de antigenen die tot expressie worden gebracht door de Borrelia bacterie die de infectie veroorzaakt. Deze mismatch kan veroorzaakt worden door de intra- en interspecies heterogeniteit van B. burgdorferi s.l [11, 18-22] en\/of de antigene variatie van de infecterende stam tijdens het verloop van de infectie [23]. De sensitiviteit van een antistoftest kan ook be\u00efnvloed worden door vroegtijdig antibiotica gebruik, wat de immuunrespons kan afbreken [24-28]. Dit antibiotica effect lijkt antistof-specifiek, aangezien antistoffen tegen het C6-peptide sneller afnemen dan antistoffen gericht tegen een cel lysaat van B. burgdorferi s.l [29, 30] of het p39-eiwit [29].\n\nIn hoofdstuk 7 zijn twee screening testen (de C6 ELISA en de Serion ELISA) en twee twee-staps teststrategie\u00ebn (confirmatie van dubieuze en positieve C6 ELISA en Serion ELISA resultaten met de recomLine immunoblot) voor het detecteren van Borrelia-specifieke antistoffen in bloed ge\u00ebvalueerd. Het onderzoek in dit hoofdstuk toont aan dat antibiotische behandeling van een infectie met B. burgdorferi s.l sterk geassocieerd is met discordante screening test (ELISA) resultaten en twee-staps teststrategie (ELISA + immunoblot) resultaten (odds ratio [OR]: 10,52; P < 0,001 en OR: 9,98; P = 0,014, respectievelijk). Dit suggereert dat antibiotische behandeling van invloed is op het tempo waarin de antistoffen gericht tegen de verschillende antigenen in de ELISAs afnemen, waarbij antistoffen tegen het C6 peptide iets sneller lijken af te nemen dan die tegen cel lysaten van B. burgdorferi s.l., en bevestigt eerdere bevindingen [29, 30]. De discordante testresultaten in onze studie worden met name verklaard door de aanwezigheid van IgM tegen het buitenmembraan eiwit (outer surface protein) OspC, en in sommige gevallen ook tegen het p41 flagel, zoals ook in eerdere studies is aangetoond [31, 32]. Deze resultaten onderschrijven de uitdagingen rondom de interpretatie van antistoftesten, waarmee men rekening dient te houden bij het gebruik van dergelijke testen voor de diagnostiek van de ziekte van Lyme.\n\nIn de vroege fase van een infectie zijn de antistoffen vaak nog niet aantoonbaar vanwege de nog opbouwende immuunrespons. Daarom zijn er nieuwe infectiemarkers nodig met een hoge sensitiviteit en specificiteit, met name in de beginfase van een infectie. In de afgelopen twee decennia zijn er steeds meer studies verschenen die de toegevoegde waarde laten zien van het aantonen van verhoogde concentraties van CXCL13 in de liquor van pati\u00ebnten met een vroege LNB [33, 34]. De detectie van CXCL13 in de liquor is relatief eenvoudig in tegenstelling tot de vaak lastige berekeningen die nodig zijn voor het aantonen van de intrathecale synthese van Borrelia-specifieke antistoffen. In hoofdstuk 4 zijn twee commerci\u00eble CXCL13-testen (de Quantikine CXCL13 ELISA en de recomBead CXCL13 test) op liquor voor de diagnostiek van LNB ge\u00ebvalueerd. Gebruikmakend van dezelfde studiepopulatie als in hoofdstuk 6 (en bijna dezelfde studiepopulatie als die in hoofdstuk 5), is aangetoond dat het meten van CXCL13 in de liquor van toegevoegde waarde kan zijn voor het diagnosticeren van pati\u00ebnten met een actieve LNB. Verder is aangetoond dat CXCL13 eerder in de liquor kan worden gedetecteerd dan intrathecaal geproduceerde Borrelia-specifieke antistoffen, en dat de bepaling van CXCL13 in de liquor met name van toegevoegde waarde is voor het aantonen van vroege LNB. De cutoff waardes voor beide testen verschillen echter wel, wat mogelijk verklaard kan worden door een verschil in methodiek [35]. Echter, in de literatuur worden ook verschillende cutoff waardes gerapporteerd bij gebruik van dezelfde testen [35-41]. Dit benadrukt de noodzaak voor verder onderzoek naar de oorzaak van deze verschillen en de mogelijkheden om een internationale referentiestandaard vast te stellen voor CXCL13 in de liquor.\n\nDe productie van CXCL13 in de liquor is onderdeel van de cellulaire immuunrespons. De cellulaire immuunrespons tegen B. burgdorferi s.l. wordt gekarakteriseerd door een sterke T helper (Th)1 respons, waarbij T cellen Th1-cytokines gaan produceren, waaronder interferon-gamma (IFN-\u03b3). In de afgelopen jaren zijn er ook andere testen beschikbaar gekomen die zich richten op de cellulaire immuunrespons. E\u00e9n van deze testen is de enzym-linked immunospot (ELISpot) test waarmee Borrelia-specifieke IFN-\u03b3 producerende T cellen worden aangetoond. In Hoofdstuk 2 en 3 zijn twee van dergelijke testen voor de diagnostiek van LNB ge\u00ebvalueerd; een zelf ontwikkelde (zgn. \u2018in-house\u2019) Borrelia ELISpot test en de commerci\u00eble LymeSpot test. Veel Lymepati\u00ebnten gaan naar Duitsland waar commerci\u00eble IFN-\u03b3 ELISpot testen worden gebruikt, terwijl de klinische validatie van deze testen bij goed gedefinieerde pati\u00ebntengroepen ontbreekt. Echter, indien de IFN-\u03b3 ELISpot testuitslag bij deze pati\u00ebnten positief is, wordt er vaak (langdurig) antibiotica gegeven voor de behandeling van actieve Lymeziekte [42]. Voor de evaluatie van de twee IFN-\u03b3 ELISpot testen in deze thesis werd gebruik gemaakt van een prospectieve \u2018case-control\u2019 studie, bestaande uit actieve LNB pati\u00ebnten (cases), en drie controlegroepen bestaande uit behandelde LNB pati\u00ebnten, en gezonde vrijwilligers met, en zonder een voorgeschiedenis van behandelde Lymeziekte (met name cutaan). De studies in hoofdstuk 2 en 3 tonen aan dat de onderzochte IFN-\u03b3 ELISpot testen niet geschikt zijn om actieve LNB te diagnosticeren. De aanwezigheid van Borrelia-specifieke T-cel reactiviteit was vergelijkbaar tussen actieve LNB pati\u00ebnten, behandelde LNB pati\u00ebnten en behandelde gezonde vrijwilligers, en deze reactiviteit was hoger dan de Borrelia-specifieke T-cel reactiviteit bij onbehandelde gezonde vrijwilligers. De verhoogde Borrelia-specifieke T-cel reactiviteit bij beide behandelde groepen wordt waarschijnlijk verklaard door een eerdere, genezen ziekte van Lyme. De IFN-\u03b3 ELISpot test lijkt derhalve onderscheid te maken tussen Borrelia-na\u00efeve en Borrelia-ge\u00efnfecteerde individuen.\n\nCONCLUSIE\n\nWij zijn van mening dat het onderzoek in dit proefschrift heeft bijgedragen aan de doelen van dit proefschrift. De belangrijkste bevinding van dit proefschrift is het veelbelovende resultaat van het gebruik van meerdere parameters voor de diagnostiek van LNB (hoofdstuk 6), waarbij zowel de humorale als de cellulaire immuunrespons een belangrijke rol spelen (hoofdstukken 4 en 6). Het combineren van verschillende parameters in een diagnostisch algoritme, waarbij verschillende aspecten van het immuunsysteem in ogenschouw worden genomen, geeft concrete en direct uitvoerbare handvatten om een duidelijker onderscheid maken tussen een actieve infectie en een eerdere doorgemaakte infectie en zal de diagnostiek van LNB verbeteren. We zijn ook van mening dat de ontwikkeling van een diagnostisch algoritme van toegevoegde waarde kan zijn voor de diagnostiek van andere Lyme manifestaties.\n\nDe variatie in de onderzochte ELISA in hoofdstuk 5 benadrukt het belang van het uitvoeren van een gedegen validatie van diagnostische testen alvorens deze worden gebruikt in de routinediagnostiek. Als alle laboratoria dit doen, en dus goed inzicht hebben in de (on) mogelijkheden van de test die zij gebruiken, zal de diagnostiek van de ziekte van Lyme verbeteren. In hoofdstuk 7 is aangetoond dat antibioticagebruik invloed heeft op de humorale immuunrespons. Dit kan eventuele verschillen in de resultaten tussen verschillende antistoftesten verklaren en dit zal zowel de laboratorium-specialisten als de artsen helpen bij het interpreteren van de resultaten van antistoftesten.\n\nTot slot geeft de gedegen evaluatie van twee IFN-\u03b3 ELISpot testen (hoofdstukken 2 en 3) inzicht in de beperkingen van deze testen om actieve LNB aan te tonen en dit is van belang voor artsen \u00e9n pati\u00ebnten. Hopelijk zal dit het onnodig antibioticagebruik op basis van onterechte diagnoses, gesteld op basis van IFN-\u03b3 ELISpot testuitslagen, beperken. De resultaten van beide studies bieden ook een basis waarmee artsen in gesprek kunnen gaan met pati\u00ebnten in het geval dat pati\u00ebnten elders met soortgelijke testen gediagnosticeerd zijn.","summary":"Lyme disease, also known as Lyme borreliosis (LB), is caused by spiral-shaped bacteria, so-called spirochetes, which are part of the Borrelia burgdorferi sensu lato (s.l.) complex group [1]. The three most prevalent B. burgdorferi s.l. species in Europe are: Borrelia afzelii, Borrelia garinii and Borrelia burgdorferi sensu stricto (s.s.), while in North America the predominant species is B. burgdorferi s.s. [2]. B. burgdorferi s.l. is transmitted by a bite from an infected Ixodes-tick, which is mainly found in temperate regions in the Northern Hemisphere [3]. The most prevalent manifestation of LB in the early phase of the infection is characterized by a red, migrating skin lesion, also known as erythema migrans (EM) [2]. If left untreated, then B. burgdorferi s.l. can disseminate through the body and infect other body parts such as the joints (Lyme arthritis), the nervous system (Lyme neuroborreliosis (LNB)), the heart (Lyme carditis) and\/or other parts of the skin (acrodermatitis chronica atrophicans) [2].\n\nThe diagnosis of LB is mainly based on the presence of clinical symptoms. The classical EM lesion is sufficient for a clinical diagnosis [4, 5]. However, in case of unclear skin lesions and\/or other Lyme manifestations, laboratory tests are needed to support and confirm the clinical diagnosis [4, 5]. These laboratory tests are based on the direct or indirect detection of B. burgdorferi s.l. [6]. Direct detection methods include microscopy, culture, or PCR; however, since the bacterium is usually present in low numbers, direct detection methods are hampered by a low sensitivity [6]. Except for PCR on skin biopsy samples (e.g., in case of symptoms consistent with EM or acrodermatitis chronica atrophicans) or synovial fluid (e.g., in case of symptoms consistent with Lyme arthritis) [6]. Indirect detection methods are based on the host\u2019s immune response against B. burgdorferi s.l., most importantly the detection of Borrelia-specific antibodies [6].\n\nThe diagnosis of active LB can be challenging as symptoms are often difficult to interpret and\/or not specific for LB [4]. The interpretation of laboratory tests can also be challenging: a negative antibody test result is no proof of the absence of active LB, and a positive antibody test result is no proof of active LB [7]. Because of these diagnostic challenges, the research in this thesis focuses on whether current the diagnostics for LB can be improved, and whether an active infection can be distinguished from a past infection. To answer these questions, current and alternative diagnostic tests and\/or algorithms are evaluated, including well-known diagnostic tests based on the humoral immune response (i.e., the detection of Borrelia-specific antibodies) and alternative diagnostic tests based on the cellular immune response (i.e., the detection of certain signaling molecules produced by so-called T cells). For this research, a study population has been established consisting of well-defined patients and controls.\n\nAs clear criteria are defined for the diagnosis of patients with LNB, we mainly focused on these patients. Patients have LNB if they fulfil at least two of the three following criteria defined by the European Federation of Neurological Societies (EFNS) [8]:\n1. Presence of neurological symptoms suggestive of LNB without another obvious reason\n2. Elevated cerebrospinal fluid (CSF) cell count (\u22655 leukocytes\/\u03bcl CSF [i.e., pleocytosis])\n3. Intrathecal synthesis of Borrelia-specific antibodies\n\nIf a patient fulfils all criteria, then the patient is classified as definite LNB; if a patient fulfils two of the three criteria (including the presence of neurological symptoms suggestive of LNB without another obvious reason), then the patient is classified as possible LNB.\n\nThe detection of intrathecally produced Borrelia-specific antibodies is, thus, important in LNB diagnostics. Many commercial antibody tests are available; however, the performance characteristics of these tests are often difficult to interpret due to variability in the study designs, heterogeneity of the study populations under investigation, and poor reporting of study characteristics [9]. Ideally, evaluation of tests is done using a prospective, cross-sectional study design in a setting where the test will be used in clinical practice. However, case-control study designs are used more often, because these are easier to perform, despite that such a study design has a risk of introducing bias [9]. This bias often occurs because the control group does not represent the same clinical background as the patient group. Consequently, the obtained results are not representing reality [9].\n\nThe most important finding of the research conducted in this thesis are the promising results described in chapter 6, as these will aid clinicians in diagnosing LNB. In this chapter, seven antibody tests for LNB diagnostics were evaluated. Therefore, a cross-sectional study design was used in which all consecutive patients of the neurology department, from whom a CSF-serum sample pair was sent to the microbiology department of the Diakonessenhuis Hospital during a certain timeframe, were retrospectively included. For each antibody test, a multiparameter analysis was conducted to investigate whether the diagnostic performance of the antibody test could be further improved by including additional parameters. These additional parameters included various routine CSF parameters (i.e., pleocytosis, total protein, blood-CSF barrier functionality and intrathecal total-antibody synthesis), a Borrelia-specific (i.e., Borrelia species PCR) and a non-specific CSF parameter (i.e., B-cell chemokine (C-X-C motif) ligand 13 [CXCL13]), and a Borrelia-specific serum parameter (i.e., Borrelia-specific serum antibodies). The results of these multiparameter analyses show that for most of the antibody assays, the use of additional parameters for the diagnosis of LNB results in higher sensitivities (range: 94.1% to 100%) and slightly lower specificities (range: 92.8% to 96.4%) than the sensitivities and specificities of the individual antibody tests (range: 47.1% to 100 % and 95.7 % to 100%, respectively). The most important parameters that contribute to improved LNB diagnostics are intrathecally produced Borrelia-specific antibodies, blood-CSF barrier functionality, intrathecal total-antibody synthesis, pleocytosis, CSF-CXCL13, and Borrelia-specific serum antibodies. Even though other studies have also shown the additional value of these parameters in LNB diagnostics [8, 10-12], our study is the first that shows the relative importance of these parameters. Furthermore, our study shows which parameters contribute the most and, consequently, are suitable to be added to a diagnostic algorithm for LNB diagnostics. Our study also shows that measurement of both the humoral and the cellular immune response against an infection with B. burgdorferi s.l. contribute to the diagnosis of LNB, and that individual parameters can either be (false) negative or (false) positive, and still be of added value in the broader context. It is our opinion that these results merit a multi-center validation. Therefore, we propose an (inter)national prospective study to investigate the potential use of a standardized diagnostic algorithm for LNB based on multiparameter analysis.\n\nOverall, the results of the multiparameter analyses in chapter 6 show that, of the included parameters, the detection of intrathecally produced Borrelia-specific antibodies contribute the most in LNB diagnostics. For the detection of pathogen-specific antibodies an enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) is often used [4]. ELISAs, however, can suffer from a so-called \u2018edge effect\u2019 [13]. An edge effect is found when the measurements of a single antibody concentration in wells located at the edges of an ELISA plate are higher (or lower) than the measurements in wells located in the center of an ELISA plate. If an ELISA plate suffers from an edge effect, then this may have consequences for the patient samples tested in this plate. In chapter 5, it is shown that the commercial Enzygnost Lyme link VlsE\/IgG ELISA suffers from an edge effect. It is also shown that the impact of the edge effect on LNB diagnostics using this ELISA could be reduced by some minor adaptations to the standard protocol of the manufacturer. This adapted protocol was subsequently used to test 149 CSF-serum sample pairs which were part of the slightly larger sample set used in chapter 6 (and 4). By simulation it was shown that if the standard protocol of the manufacturer would have been used, then the edge effect for this study population in a \u2018worst-case\u2019 scenario could have resulted in 15 (10.1%) false-positive and two (1.3%) false-negative Borrelia-specific IgG antibody index results. The observed edge effect can, thus, lead to inaccurate LNB diagnostics. The results in chapter 5 underline the importance of a thorough validation of ELISAs before use in routine diagnostics as is required, for instance, by the ISO 15189 accreditation [14].\n\nThe diagnosis of most of the other Lyme manifestations is supported by the detection of Borrelia-specific antibodies in blood, for which a two-tier test strategy is recommended [5, 15]. This two-tier test strategy aims to improve the diagnostic performance of laboratory tests by combining a highly sensitive first test (i.e., a screening test) with a highly specific second test (i.e., a confirmation test) to confirm equivocal and positive test results obtained in the first test [7, 16, 17]. The screening test often comprises an ELISA, and the confirmation test is based on either a western blot (North America) or an immunoblot (Europe) [7]. Antibody tests can vary in sensitivity, as is shown in chapter 6, which can result from a mismatch between the antigens applied in the assay and those expressed by the Borrelia bacterium during an active infection. This discrepancy can be caused by the intra- and interspecies heterogeneity of B. burgdorferi s.l. [11, 18-22] and\/or antigenic variation used by the infecting strain during the course of the disease [23]. The sensitivity of an antibody test can also be influenced by early antibiotic treatment, as this can abrogate the immune response [24-28]. This abrogation seems to be antibody-specific, as antibodies against the C6-peptide wane faster than those against a whole-cell lysate of B. burgdorferi s.l. [29, 30] or protein (p)39 [29].\n\nIn chapter 7, two screening tests (i.e., the C6 ELISA and the Serion ELISA) and two two-tier test strategies (confirmation of equivocal and positive C6 ELISA and Serion ELISA test results using the recomLine immunoblot) for the detection of Borrelia-specific serum antibodies were evaluated. The research in this chapter shows that antibiotic treatment of an infection with B. burgdorferi s.l. is highly associated with discordant screening test (ELISA) results and two-tier test strategy (ELISA + immunoblot) results (odds ratio [OR]: 10.52; P < 0.001 and OR: 9.98; P = 0.014, respectively). This suggests that antibiotic treatment influences the pace at which the different Borrelia-specific antibodies wane, as antibodies against the C6 peptide appear to wane faster than those against whole-cell lysates of B. burgdorferi s.l., which confirm previous findings [29, 30]. Most of the discordant test results in our study were explained by the presence of IgM against outer surface protein (Osp)C, and for some test results also against p41 flagellin, as was also shown in earlier studies [31, 32]. These results underline the challenges with regard to the interpretation of antibody tests which should be taken into account when such tests are used for the diagnosis of LB.\n\nIn the early phase of an infection, antibody levels are still too low to be detected as the immune response has to be build up. Consequently, there is a need for markers of infection with high sensitivity and specificity, especially in the first few weeks after infection. In the last two decades, various studies have been published that have shown the added value of elevated levels of CXCL13 in the CSF of patients with early LNB [33, 34]. The detection of CXCL13 in the CSF is relatively easy in contrast to the often complex calculations needed to proof the intrathecal synthesis of Borrelia-specific antibodies. In chapter 4, two commercial CXCL13 tests (the Quantikine CXCL13 ELISA and the recomBead CXCL13 test) on CSF for LNB diagnostics were evaluated. Using the same study population as the one in chapter 6 (and almost the same study population as the one in chapter 5), it is shown that measuring the CXCL13 level in CSF is of added value for the diagnosis of patients with active LNB. It was also shown that CXCL13 can be detected in the CSF prior to intrathecally produced Borrelia-specific antibodies, and that measuring CXCL13 in the CSF is especially useful in the diagnosis of early LNB. The cutoff values for both tests, however, differ and this might be caused by differences in methodology [35]. Also in the literature, different cutoffs are reported for the same tests [35-41]. Therefore, more research is needed to elucidate the reasons behind these differences and to investigate whether an international reference standard for CXCL13 in the CSF can be established.\n\nThe production of CXCL13 in the CSF is part of the cellular immune response. The cellular immune response against B. burgdorferi s.l. is characterized by a strong T helper (Th)1 response in which T cells will produce Th1-cytokines, among which interferon-gamma (IFN-\u03b3). In the past years, other tests that focus on the cellular immune response have also become available. One of these tests is the enzyme-linked immuno spot (ELISpot) test in which Borrelia-specific IFN-\u03b3 producing T cells are detected. In chapters 2 and 3, two of such tests for LNB diagnostics were evaluated: an in-house Borrelia ELISpot test and the commercial LymeSpot test. Many Lyme patients go to Germany, where commercial IFN-\u03b3 ELISpot tests are used, even though the clinical validation of these tests on well-defined patient populations are lacking. Yet, when the IFN-\u03b3 ELISpot test result for these patients is positive, often (long-term) antibiotic treatment is given [42]. For the evaluation of the two IFN-\u03b3 ELISpot tests in this thesis, a prospective \u2018case-control\u2019 study was used comprising of active LNB patients (i.e., cases), and three control groups comprising treated LNB patients, and healthy individuals with - and without - a history of treated LB (mainly cutaneous). The studies in chapters 2 and 3 show that both IFN-\u03b3 ELISpot tests cannot be used to prove active LNB. The presence of Borrelia-specific T-cell reactivity was comparable between active LNB patients, treated LNB patients and treated healthy individuals, and this reactivity was higher than the Borrelia-specific T-cell reactivity among untreated healthy individuals. The elevated Borrelia-specific T-cell reactivity among both treated groups is most likely explained by a previous, cured LB. The IFN-\u03b3 ELISpot test, thus, seems to differentiate between Borrelia-naive and Borrelia-infected individuals.\n\nCONCLUSION\n\nWe believe that the research in this thesis has contributed to the aims of this thesis. The most important contribution of this thesis is the promising result of using multiple parameters for the diagnosis of LNB (chapter 6), in which both the humoral and the cellular immune response are important contributors (chapters 4 and 6). Combining various parameters into a diagnostic algorithm, in which different aspects of the immune system are covered, provides a concrete and feasible tool to better discriminate between an active infection and a previous infection and will consequently improve LNB diagnostics. We also believe that the construction of a diagnostic algorithm will be of added value for the diagnosis of other Lyme manifestations.\n\nThe intra-assay variation of the ELISA investigated in chapter 5 underlines the need of a thorough validation of diagnostic tests before such tests will be used in routine diagnostics. If all laboratories adhere to this, then it will provide them insight into the (im)possibilities of the test that is used, and this will improve LB diagnostics. In chapter 7 it is shown that antibiotic treatment influences the humoral immune response, which can explain the differences in test results between different antibody tests. This knowledge will support laboratory specialists as well as medical specialists in the interpretation of antibody tests.\n\nFinally, the thorough evaluation of two IFN-\u03b3 ELISpot tests (chapters 2 and 3) provides insight into the limitations of the use of these tests for the diagnosis of active LNB and this knowledge is relevant for both medical specialists and patients. Hopefully this can prevent unnecessary antibiotic treatment by incorrect diagnoses, based on IFN-\u03b3 ELISpot test results. The results of both studies will also provide a means for medical specialists to talk with patients in the event that these patients have been diagnosed with similar tests elsewhere.","auteur":"Tamara Van Gorkom","auteur_slug":"tamara-van-gorkom","publicatiedatum":"8 december 2022","taal":"NL","url_flipbook":"https:\/\/ebook.proefschriftmaken.nl\/ebook\/tamaravangorkom?iframe=true","url_download_pdf":"","url_epub":"","ordernummer":"FTP-202604101023","isbn":"978-94-646-9091-0","doi_nummer":"","naam_universiteit":"Universiteit Leiden","afbeeldingen":12328,"naam_student:":"","binnenwerk":"","universiteit":"Universiteit Leiden","cover":"","afwerking":"","cover_afwerking":"","design":""},"_links":{"self":[{"href":"https:\/\/www.proefschriftmaken.nl\/en\/wp-json\/wp\/v2\/us_portfolio\/11029","targetHints":{"allow":["GET"]}}],"collection":[{"href":"https:\/\/www.proefschriftmaken.nl\/en\/wp-json\/wp\/v2\/us_portfolio"}],"about":[{"href":"https:\/\/www.proefschriftmaken.nl\/en\/wp-json\/wp\/v2\/types\/us_portfolio"}],"author":[{"embeddable":true,"href":"https:\/\/www.proefschriftmaken.nl\/en\/wp-json\/wp\/v2\/users\/8"}],"replies":[{"embeddable":true,"href":"https:\/\/www.proefschriftmaken.nl\/en\/wp-json\/wp\/v2\/comments?post=11029"}],"version-history":[{"count":1,"href":"https:\/\/www.proefschriftmaken.nl\/en\/wp-json\/wp\/v2\/us_portfolio\/11029\/revisions"}],"predecessor-version":[{"id":11032,"href":"https:\/\/www.proefschriftmaken.nl\/en\/wp-json\/wp\/v2\/us_portfolio\/11029\/revisions\/11032"}],"wp:featuredmedia":[{"embeddable":true,"href":"https:\/\/www.proefschriftmaken.nl\/en\/wp-json\/wp\/v2\/media\/12328"}],"wp:attachment":[{"href":"https:\/\/www.proefschriftmaken.nl\/en\/wp-json\/wp\/v2\/media?parent=11029"}],"wp:term":[{"taxonomy":"us_portfolio_category","embeddable":true,"href":"https:\/\/www.proefschriftmaken.nl\/en\/wp-json\/wp\/v2\/us_portfolio_category?post=11029"}],"curies":[{"name":"wp","href":"https:\/\/api.w.org\/{rel}","templated":true}]}}