{"id":11017,"date":"2026-04-10T10:18:58","date_gmt":"2026-04-10T10:18:58","guid":{"rendered":"https:\/\/www.proefschriftmaken.nl\/portfolio\/tale-sliedrecht\/"},"modified":"2026-04-22T14:58:38","modified_gmt":"2026-04-22T14:58:38","slug":"tale-sliedrecht","status":"publish","type":"us_portfolio","link":"https:\/\/www.proefschriftmaken.nl\/en\/portfolio\/tale-sliedrecht\/","title":{"rendered":"Tale Sliedrecht"},"content":{"rendered":"","protected":false},"excerpt":{"rendered":"","protected":false},"author":8,"featured_media":12312,"comment_status":"closed","ping_status":"closed","template":"","meta":{"_acf_changed":false,"footnotes":""},"us_portfolio_category":[45],"class_list":["post-11017","us_portfolio","type-us_portfolio","status-publish","has-post-thumbnail","hentry","us_portfolio_category-new-template"],"acf":{"naam_van_het_proefschift":"Probing MPSN function in mitosis","samenvatting":"Voor niet ingewijden\n\nHet menselijk lichaam is opgebouwd uit miljarden cellen, deze cellen vormen de bouwstenen voor alle verschillende weefsels en organen waaruit ons lichaam bestaat. Het is dan ook niet verwonderlijk dat er honderden verschillende soorten cellen zijn met elk een specifieke functie en vorm naargelang hun taak in het lichaam. De slijtgevoelige darmwand bijvoorbeeld, bevat snel reproducerende cellen die zijn gespecialiseerd in het afscheiden van darmsappen voor de spijsvertering. Terwijl de neuronen in de hersenen zijn gespecialiseerd in het ontvangen en doorgeven van signalen.\n\nOndanks de verschillende taken van de cellen bevatten ze allen het identieke handleidingenboek \u201chet DNA\u201d dat ligt opgeslagen in de celkern. In dit handleidingenboek staan de instructies die nodig zijn voor een cel om goed te functioneren. Afhankelijk van de vari\u00ebrende functies van cellen zullen de instructies per celtype verschillen. Het handleidingenboek bestaat uit 46 hoofdstukken, ofwel chromosomen. Tijdens de bevruchting heeft u 23 hoofdstukken van uw moeder meegekregen en de andere 23 van uw vader. Vanaf het moment van de bevruchting zijn we begonnen met delen om vervolgens niet meer te stoppen. Het proces van celdeling staat aan de basis van de ontwikkeling van alle organismen en het is dit wonderlijke proces dat ik de afgelopen vijf jaar heb bestudeerd en waarvan de onderzoeksresultaten beschreven staan in dit proefschrift.\n\nCeldeling\n\nDe deling van \u00e9\u00e9n \u2018moedercel\u2019 in twee nieuwe \u2018dochtercellen\u2019 wordt mitose genoemd. E\u00e9n van de meest essenti\u00eble taken van de mitose is het eerlijk verdelen van het erfelijk materiaal op een dusdanige manier dat beide dochtercellen uiteindelijk exact dezelfde kopie van het handleidingenboek bezitten. Voordat een cel dus kan overgaan tot de mitose zal eerst het erfelijk materiaal, het DNA, moeten worden verdubbeld. Nadat alle 46 chromosomen foutloos zijn overgeschreven blijven kopie en origineel - die we nu zusterchromosomen noemen - aan elkaar gebonden. De cel is nu klaar voor de mitose.\n\nMitose is opgedeeld in meerdere opeenvolgende fasen (zie figuur 1), tijdens de eerste fasen, de \u2018pro- en prometafase\u2019 genoemd, groeien vanuit twee tegenoverliggende polen dynamische draden, microtubuli, om een spoelfiguur te vormen. In deze fasen moeten de microtubuli van het spoelfiguur de zusterchromosomen zien te binden. Na veel duw- en trekwerk zullen alle zusterchromosomen zich uiteindelijk in het midden van de cel bevinden. Op het moment dat de ene zuster via microtubuli gebonden is aan \u00e9\u00e9n pool, en de andere zuster aan de tegenoverliggende pool heeft de cel \u2018metafase\u2019 bereikt en is klaar om te delen. De zusterchromosomen worden fysiek van elkaar gescheiden en netjes verdeeld over de twee dochtercellen in \u2018anafase\u2019. De uiteindelijke vorming van de twee nieuwe dochtercellen vindt plaats in de laatste fasen; \u2018telofase en cytokinese\u2019 van de mitose. In deze fasen begint het celmembraan in het midden in te snoeren tot er een scheiding tussen de twee cellen optreedt. Uit \u00e9\u00e9n cel hebben zich aldus twee cellen gevormd met precies hetzelfde erfelijk materiaal.\n\nHet Mitotische Checkpoint\n\nHet is van essentieel belang dat er tijdens de deling geen fouten worden gemaakt in de chromosoomverdeling. Het goed functioneren van de cel wordt door het genetisch materiaal bepaald en het hebben van een verkeerd aantal chromosomen (aneuploidy) kan desastreuze gevolgen hebben. Aneuploidy is een kenmerk van bijna alle tumoren, het is echter nog onduidelijk of het maken van fouten tijdens de celdeling bijdraagt aan het ontstaan van kanker. Naast de aanwezigheid van aneuploidy in kanker, heeft de aanwezigheid van een verkeerd aantal chromosomen ook tijdens de humane ontwikkeling grote effecten. Dit wordt bijvoorbeeld ge\u00efllustreerd in het syndroom van Down, waarbij de aanwezigheid van een extra chromosoom (nummer 21) grote gevolgen heeft. Om aneuploidy te voorkomen, beschikt de cel over een controlemechanisme, het mitotische checkpoint, welke de voortgang van de deling nauwlettend in de gaten houdt.\n\nAan de basis van het mitotische checkpoint staat het kinetochoor, een structuur van eiwitten die zich aan weerszijden van de zusterchromosomen bevindt. De kinetochoor vormt de bindingsplaats voor microtubuli. In afwezigheid van stabiel gebonden microtubuli zal het kinetochoor een stopsignaal produceren welke de deling van de cel tegenhoudt. Pas als alle kinetochoren stabiel gebonden zijn in metafase (\u00e9\u00e9n zusterschromosoom met de ene pool, en de andere zuster met de tegenoverliggende pool) laat het mitotische checkpoint deling van de zusterchromosomen toe. De microtubuli trekken de dan gescheiden zusters naar de tegenoverliggende kanten van de cel.\n\nHet onderzoek beschreven in dit proefschrift\n\nOndanks het belang van het mitotische checkpoint, is het nog onduidelijk hoe veel aspecten van het mitotische checkpoint functioneren. Een groep eiwitten genaamd kinasen, vervullen een centrale rol in mitose en het mitotische checkpoint. E\u00e9n van deze kinasen, genaamd MPS1, staat centraal in het onderzoek beschreven in dit proefschrift. Alvorens ik het onderzoek omtrent MPS1 bespreek, is het van belang het functioneren van kinasen kort toe te lichten. Een belangrijk mechanisme dat cellen gebruiken om een signaal door te geven is het aanbrengen van een modificatie op een ander eiwit. E\u00e9n van de bekendste en meest onderzochte modificaties, is het aanbrengen van een fosfaatgroep op een eiwit. Dit mechanisme, fosforylering genaamd, reguleert een breed scala van cellulaire processen. De introductie van een negatief geladen fosfaatgroep kan de structuur en activiteit van een eiwit veranderen of de interacties met andere eiwitten verstoren of stimuleren. Kinasen bezitten de enzymatische activiteit om een fosfaatgroep te koppelen aan andere eiwitten. Een kleine groep kinasen is verantwoordelijk voor de regulatie van het mitotische checkpoint.\n\nFiguur 1. Schematische weergave van de celdeling\nVoor aanvang van de celdeling bevinden de verdubbelde chromosomen zich nog in de celkern, wanneer de celkern aan het begin van de mitose afbreekt vormt zich een spoelfiguur (prometafase). De dynamische draden (microtubuli) van het spoelfiguur binden de zusterchromosomen op gespecialiseerde aanhecht plaatsen (kinetochoren). Na veel duw en trekwerk bevinden de zusterchromosomen zich in het midden van de cel (metafase). De zusters worden van elkaar gescheiden in anafase en elk naar een kant van de cel getrokken. Tijdens de laatste fase van de celdeling zullen de twee dochtercellen zich vormen, beiden met een gelijke hoeveelheid chromosomen. Fouten tijdens de celdeling die mogelijk voortkomen uit een slecht functionerend mitotisch checkpoint leiden tot een ongelijke hoeveelheid chromosomen in de dochtercellen (aneuploidy).\n\nHet belang van het MPS1 gen voor het mitotische checkpoint werd in 1996 voor het eerst beschreven in gist. Later bleek dat ook het humane MPS1 essentieel is voor het goed functioneren van het checkpoint. Zonder MPS1 (of MPS1 activiteit) zullen cellen delen terwijl \u00e9\u00e9n of meerdere kinetochoren niet aan microtubuli gehecht zijn, met aneuploidy als gevolg. Uit recentelijk onderzoek blijkt dat MPS1 op meerdere manieren het checkpoint be\u00efnvloedt.\n\nIn hoofdstuk 1 behandel ik wat in de literatuur bekend is over mitose, de kinetochoor, het mitotische checkpoint en wat de rol van MPS1 hierin is.\n\nOm een beter beeld te krijgen van alle verschillende functies van MPS1 in mitose wordt in hoofdstuk 2 beschreven hoe wij door middel van mutaties in het ATP bindingsdomein van MPS1, het kinase gevoelig hebben gemaakt voor chemische remmers. Deze aanpak stelde ons in staat MPS1 activiteit op zeer snelle en specifieke wijze te remmen. Deze remming van MPS1 bleek een handig hulpmiddel om de functie van MPS1 in mitose te bestuderen. Een belangrijke functie van MPS1 is het rekruteren van andere checkpoint eiwitten naar de kinetochoor.\n\nIn hoofdstuk 3 onderzoeken we hoe MPS1 het checkpoint eiwit MAD1 naar de kinetochoor rekruteert. Kinetochoor lokalisatie van MAD1 is essentieel voor het goed functioneren van het checkpoint. Naast MPS1 heeft ook het checkpoint kinase BUB1 en het MAD1-rekruterende eiwit ZW10 invloed op de lokalisatie van MAD1. Wij hebben ontdekt dat al deze eiwitten samenwerken om de lokalisatie van MAD1 naar de kinetochoor te reguleren.\n\nHoofdstuk 4 beschrijft de zoektocht naar nieuwe regulatoren van het mitotische checkpoint. Uit recentelijk onderzoek is gebleken dat niet alle regulatoren van het checkpoint essentieel zijn. De functie van deze eiwitten in het checkpoint komt pas aan het licht als het checkpoint verzwakt is en gevoelig is voor kleine veranderingen. Onze data laat zien dat het kinase PLK1 een dergelijke niet-essenti\u00eble regulator van het checkpoint is. PLK1 heeft veel verschillende functies in mitose, hierdoor is de door ons beschreven functie in het checkpoint tot nu toe onderbelicht gebleven. Onze data laat zien dat PLK1 activiteit alleen essentieel wordt wanneer het checkpoint verzwakt is. Een situatie die waarschijnlijk gelijk staat aan een cel met nog maar \u00e9\u00e9n of twee niet gebonden kinetochoren.\n\nOndanks het belang van MPS1 in het mitotische checkpoint was er bij aanvang van mijn promotieonderzoek nog geen enkel eiwit bekend dat wordt gefosforyleerd door MPS1 om het checkpoint te reguleren. Hoofdstuk 5 beschrijft het gebruik van kwantitatieve massaspectrometrie om nieuwe substraten van MPS1 te identificeren. Met behulp van massaspectrometrie kan bepaald worden of een eiwit gefosforyleerd is. Wij beschrijven verschillende experimentele methodes die wij hebben gebruikt om te bepalen welke eiwitten worden gefosforyleerd door MPS1.\n\nAlle experimentele data in dit proefschrift wordt in hoofdstuk 6 samengevat en bediscussieerd in het licht van relevante literatuur. Het beschreven onderzoek heeft nieuwe inzichten geboden in het mitotische checkpoint en roept nieuwe vragen op. Aan de hand van deze vragen doe ik tevens suggesties voor toekomstig onderzoek.\n\nDank\n\nBeste Geert, het was me wat de afgelopen vijf jaar. Wat heb ik veel van je geleerd. Jouw kijk op wetenschap is verfrissend en aanstekelijk. Bedankt voor al je geduld tijdens mijn promotie en vooral ook tijdens het schrijfproces (Martine, sorry van je vakantie, ik maak het nog een keer goed). Naast de wetenschap kon je me tevens ook een beetje wijsmaken in het ouderschap en heb je me regelmatig de les gelezen op de squashbaan. Misschien moeten we binnenkort nog eens een potje squashen dan hoef ik je niet meer te laten winnen nu mijn doctoraat binnen is.\n\nDan de paranimfen. Mathijs, de afgelopen jaren zouden een stuk minder \u201cnice, nice\u201d zijn geweest zonder jou. Onze gedeelde passie voor biertjes, een bakkie, tafeltennis (wie stond er ook alweer voor?) het JSF en zowaar ook nog de wetenschap maakte het elke dag weer een dolle boel op het Stratenum. Andre, wie had kunnen denken dat uitgerekend de persoon die mijn pogingen tot studeren altijd systematisch wist te interrumperen met de vraag biertje......? of eitje.......? naast mij zou staan tijdens mijn verdediging. Ik ben blij dat we na al die jaren de passie voor biertjes en eitjes niet verloren zijn.\n\nDan de rest van de \u201cKops groep\u201d. Dames eerst!, Nannette, Saskia en Aniek, dank jullie wel voor het warme welkom op het lab en voor alle wijze lessen op het lab en daarbuiten. Dan Wilco, de man met duizend namen. De beste is toch wel WIKI Woelmeister, want wat weet jij veel. Ik ga alle woelies missen en het wordt even wennen om je na vijf jaar niet meer elke dag te zien. Vincent, \u2018my man in the Heck lab\u2019. We hebben wat af gemass-spect, helaas niet met het gewenste resultaat. Misschien was het dan toch KI-67, bedankt voor alle peptides! Ade, you amazed me with all your models. Your view on science is exceptional and I learned a lot from you, thanks dude. Dan alle nieuwe aanwas Snees, Manja, Richard, Wilma, Carlos, Nina, Ajit, Antoinette, (bedankt voor de PLK1 proeven) Eelco, Bas, Claudia, Roy, Tim en Debby. Benaf, ik vond het leuk om de laatste maanden met je samen te werken, ik geloof dat het wel goed gaat komen met jou. Jasmin! Mijn student met een voorkeur voor enzymen met exotische (licht vulgaire) namen. Je onsamenhangende verhalen, het gebruik van het woord giecheltje, de gezelligheid en interesse in het onderzoek maakten de 9 maanden dat je er was erg leuk. Ik hoop dat je wat van me geleerd hebt, bedankt!\n\nDan alle kansloze AIO\u2019s, waarvan de helft toch helemaal niet zo kansloos is. Rick (dem Book), Andree, Astrid, Maaike, Arne (hoe kwam je nou precies aan die bijnaam van je?), en Pascal, kopjes koffie, biertjes, lekker eten en voornamelijk de rest van het Stratenum door het slijk halen was toch het leukste met jullie.\n\nNiets werkt beter dan je wetenschappelijke frustraties van je afslaan met een goed potje squash! Livio jouw scheldkanonnades, overmatig zweten, geboer en overweldigende vorming van sop onder de douche zal ik missen en niet te vergeten je hulp bij de microscopen. Sander, Niels en Peter jullie slappe gelul (Niels), briljante\/tragische slechte woordgrappen (Sander) en scheten (Peter) en alle biertjes bij Olympus zal ik missen. David, Rutger, Maria, Maike, Jonne, Wytze, Lenno, Martijn, Anna, WJ, Anneke, Sarah, bedankt voor alle gezelligheid. En niet te vergeten Lars, de eerste jaren met jou en Wilco op de mannenkamer waren echt top, hoe gaat het eigenlijk met mijn bosjesman? En natuurlijk de rest van de Timmers, Vermeulen, Burgering, Bos, Lens, Dansen, Holstege, Voest, Rowland en Medema labs bedankt voor alle gezelligheid. Cristina, de jaarurenkaart bij jou inleveren was altijd weer een groot avontuur en ik mis het eigenlijk best wel.\n\nDaarnaast was mijn onderzoek regelmatig onderhevig aan de kritische blik van vele wetenschappers van de Medema en Lens groepen. Iedereen bedankt voor het meedenken. Susanne, dank dat je in mijn leescommissie zat en succes met het professorschap. Ren\u00e9, je kritische blik ontgaat niets, dat in combinatie met je platte humor maakte werken met je heel prettig, bedankt.\n\nDe leden van de beoordelings- en OiO commissie: Tobias en Albert heel erg bedankt voor de bijdrage tijdens de jaarlijkse evaluatie en het lezen van dit proefschrift. Judith Klumperman en Frank Holstege bedankt voor het lezen en beoordelen van dit proefschrift.\n\nAbdel, het was fijn om in een wetenschappelijke omgeving iemand als jou tegen te komen. Ik ken weinig mensen die zoveel lachen en zoveel kletsen. Ik ben blij dat ik je heb leren kennen.\n\nPap en Mam, wat leuk dat jullie een paar keer op het lab zijn geweest. Het is en zal een mysterie blijven wat ik nou eigenlijk heb gedaan de afgelopen vijf jaar, maar ik besef maar al te vaak dat deze dag er niet zou zijn geweest zonder de degelijke basis die jullie hebben gelegd. Bedankt voor de FF-en lijst, Bonnie, remedial teaching, bijles Duits, half 6 naar de Jan Ligthart en alle andere dingen die ik in de loop der jaren ben vergeten. Eelke bedankt dat je al mijn Nederlandse stukken op fouten hebt gecorrigeerd. De Nederlandse taal blijft ondanks alle bovengenoemde maatregelen niet mijn sterkste kant.\n\nLieve Tessel. Ik heb de afgelopen anderhalf jaar vaak moeten kiezen tussen nog een western blot inzetten of nog net op tijd thuis zijn om jou op bed te leggen. Jij trok vaak aan het langste eind! Ook al klaag ik vaak (vanochtend werd je om half 6 wakker!!!!!) en zal ik dat waarschijnlijk blijven doen. Je bent en blijft de leukste.\n\nLiefste Mari, al te veel woorden zal ik er niet aan vuil maken. Maar de afgelopen 5 jaar waren een stuk minder leuk geweest zonder jou aan mijn zijde. Je weet de wetenschappelijke sores altijd goed te relativeren (fotosynthese is overrated!). Ik ben blij dat je me na een dag werken in elke vorm accepteert; als P de P, Malarie, de Zieligheid, neutraal, of gewoon lekker hangend op de bank. Dank je voor alles, je bent de liefste.","summary":"The importance of MPS1 in mitosis has been established for several years. Even though recent years have seen quite some development in the elucidation of the molecular pathways concerning MPS1 signaling, many aspects remained to be uncovered at the onset of the research presented in this thesis. In Chapter 2 we report the development of mutant cell lines that allow specific, highly penetrant and reversible inhibition of MPS1, providing us with the opportunity to study the role of MPS1 in mitosis. One of these functions - the recruitment of MAD1 to unattached kinetochores - is studied in more detail in Chapter 3. We provide evidence that feedback control between MPS1, BUB1 and ZW10 regulates MAD1 kinetochore recruitment and subsequent SAC activity. In this chapter, we furthermore show that the predominant function for RZZ and BUB1 in SAC signaling is ensuring MAD1 localization. Chapter 4 describes the identification of PLK1 as an auxiliary factor in the establishment and maintenance of the SAC. Under conditions of maximal SAC activity, PLK1 is dispensable, but when SAC signaling is suboptimal, PLK1 becomes essential to maintain SAC signaling. Our data suggest that under these conditions PLK1 activity promotes MCC stability. The work presented in Chapter 5 describes the efforts put into identification of direct MPS1 targets and provides useful lessons for future investigation in the search for novel MPS1 targets.\n\nDiscussion\n\nThe role of MPS1 in the SAC\nMPS1 has long been known to be involved in maintenance of the SAC 129,135. In Chapter 2 we used chemical genetics to investigate the role of MPS1 in mitosis. In accordance with previous studies we found MPS1 kinase activity to be essential for SAC activity, the recruitment of checkpoint proteins to kinetochores and MCC formation. In Chapter 3 we investigated in particular the role of MPS1 in the recruitment of MAD1. We reveal that MPS1-dependent recruitment of MAD1 is mediated by BUB1 and ZW10. BUB1 was recently shown to be recruited to KNL1 by MPS1-dependent phosphorylation of conserved MELT-like motifs 118-120. BUB1 therefore may be the crucial and perhaps even the only effector for MPS1 in regulating MAD1 kinetochore recruitment. We were unable to prove this, however, since a kinetochore-tethered BUB1 could not rescue MAD1 kinetochore levels in MPS1-inhibited cells (not shown). This may mean that MPS1 has additional impact on kinetochore MAD1 or, alternatively, that tethered BUB1 cannot recapitulate BUB1\u2019s role in MAD1 localization. With regards to the first option, MPS1 has been shown to phosphorylate MAD1 in yeast 137 but to date a specific phosphosite or functional role for this phosphorylation in the SAC has not been reported. Interestingly in Chapter 5 we identify multiple MAD1 sites that are regulated upon MPS1 inhibition. Mutation of these sites did not, however, influence MAD1 kinetochore localization (data not shown), although this does not exclude the possibility of additional, unidentified MPS1-dependent MAD1 phosphoresidues that impact its localization. Alternatively, the sites we identified might contribute to the recently identified role of MPS1 kinase activity in regulating MAD2 dimerization 90. The recent development of antibodies specifically recognizing O-MAD2 90,237 and C-MAD2 267 might be helpful in investigating this.\n\nMAD2 itself is also an interesting candidate for direct regulation by MPS1, since both the MAD2 conformational change and MCC stability require MPS1 activity 90,91. Fission yeast Mad2 is phosphorylated by Mps1 in vitro and a Mad2 mutant lacking all five sites was SAC deficient 150. Contrary to intuition, phosphorylation of Ser187 of Fission yeast Mad2 was suggested to reduce Mad2-Mad1 binding in fission yeast, suggesting that Mps1 kinase activity inhibits aspects of SAC signaling. In line with this, phosphorylation of the C-terminal region of human MAD2 has also been shown to negatively regulate checkpoint activity by inhibiting the conformational transition of MAD2 268,269. Thus, there is currently no evidence that the MPS1-dependent regulation of MAD2 structural conversion to activate the SAC occurs via direct phosphorylation. Rather, it seems more likely that MPS1 promotes the MAD2 conformational change indirectly, for instance by activating\/recruiting a protein phosphatase that counteracts inhibitory phosphorylations. Any of these mechanisms could also account for the observed impact of MPS1 activity on MCC stability.\n\nIn addition, the other MCC subunits BUBR1 and CDC20 are also subjected to phosphorylation and other post translation modifications 41,85,233,270,271. MPS1-mediated MCC stability might thus also be promoted via CDC20 or BUBR1. Another intriguing option is that MPS1 does not actively promote MCC stability but rather counters its disassembly. There are several, possibly related, mechanisms described that promote MCC disassembly. These include p31 comet-mediated extraction of MAD2 from the MCC, aided by CDK1-dependent phosphorylation of CDC20 and possibly by CUEDC2 110,112,270,272, and auto-ubiquitination of CDC20, aided by APC15 and perhaps even by p31 comet 102-105,111,112. Any of these events could be impacted by MPS1 activity. Due to the complexity of the pathways, I propose that the best way to identify the mechanisms by which MPS1 regulates the various aspects of SAC signaling is quantitative proteomics studies of protein complexes. For a more elaborate discussion, see below.\n\nBudding yeast NDC80 can be phosphorylated by MPS1 in vitro, and some evidence in budding yeast supports the idea that MPS1-dependent phosphorylation of NDC80 contributes to SAC activity 263. Although both human and budding yeast MPS1 require HEC1\/NDC80 for its recruitment to kinetochores 142,145,146,263,273, there is no evidence that the phosphoregulation of HEC1\/NDC80 by MPS1 is conserved in humans. Indeed, despite extensive phosphoproteomic examinations of the KMN network (8,14,202, and our data in Chapter 5), no MPS1-like sites in the tail of HEC1\/NDC80 have been found. We furthermore showed previously that the sole function of HEC1\/NDC80 in SAC signaling in human cells is recruitment of MPS1 to kinetochores 146, so it seems unlikely that MPS1 itself could initiate that event. It is of interest to note that the mitotic kinase NEK2 was reported to phosphorylate HEC1 in its CH domain on Ser165, a phosphorylation that was shown to modulate SAC activity in human cell 12,264. Although the fact that NEK2 is degraded in early mitosis 274 argues against a prominent role for this kinase in the SAC, these findings could indicate that SAC-modulating phosphorylation of HEC1 is present in human cells as it is in yeast, even if the kinase may not be conserved. Interestingly, in Chapter 5 we found phosphorylation of SPC24, a member of the NDC80 complex, to be regulated. Future experiments need to elucidate if SPC24 phosphorylation in humans serves a similar purpose as NDC80 phosphorylation in yeast. Relatively straightforward RNAi rescue experiments of SPC24 phosphosite mutants should give an initial clue as to whether the SAC, weakened or not, depends to some extent on SPC24 phosphorylation. More sophisticated subsequent analysis will be needed to determine the mechanism by which such phosphoresidues might act.\n\nIdentification of novel MPS1 targets\nDespite the multiple critical functions of MPS1 in mitosis, only a limited number of targets proteins have been identified and studied in detail 118-120,164. It has proven to be quite difficult to identify bona fide MPS1 substrates, which might stem from low abundance of MPS1 substrates, low phosphorylation site occupancy, lack of a well-defined consensus motif and lack of stringent binding between MPS1 and its substrates. The latter finds support in the above-mentioned studies that, although successful at identifying KNL1 and Borealin as direct MPS1 substrates, fail to identify a direct interaction between MPS1 and its substrates. The recent developments in quantitative MS-based proteomics have allowed the identification of a large number of in vivo phosphorylation sites from complex samples and has proven a successful method for the identification of PLK1, Aurora B and CDK1 substrates 235,251-253. Chapter 5 describes the experimental optimization of quantitative phosphoproteomics methods aimed at identifying new MPS1 substrates.\n\nAlthough our search has yielded several interesting candidates which will be subjected to future research, we conclude that the different experimental set-ups used were not ideal for the identification of MPS1 substrates. Although we have been successful in identifying large quantities of phosphopeptides, the relative abundance of kinetochore- and spindle-associated proteins was low. Furthermore, the amount of significantly regulated, MPS1-dependent phosphopeptides also seems relatively low compared to, for instance, studies that used similar approaches to identify PLK1 substrates 235,251. The latter might imply that MPS1 regulates the SAC and error-correction through only a small number of target proteins. However, since we also failed to identify the presumably heavily phosphorylated bona-fide MPS1 substrate KNL1 67,118-120, we suspect that poor recovery of kinetochore and spindle proteins has limited successful identification of novel MPS1 targets.\n\nSeveral recent studies have circumvented this by selective enrichment of phosphorylated substrates of a kinase of interest using chemical genetics 275-277. Using the analog-sensitive MPS1 mutants described in Chapter 2, we attempted similar approaches. Unfortunately, poor activity of recombinant gatekeeper MPS1 mutants prevented us from using such analyses to identify MPS1 substrates. Since I feel that defining the MPS1 substrates and pinpointing the relevant phosphoresidues is key in understanding the mechanisms of SAC control, this begs the question how future research towards the identification of novel MPS1 substrates should be directed? Although quantitative phosphoproteomics provides us with the opportunity to identify phosphorylation sites that occur at least in cell culture conditions, future research might benefit from selective enrichment of kinetochore and spindle-associated proteins and protein complexes. It was recently shown that native kinetochore particles can be isolated from budding yeast by affinity capture of the MIS12 complex component Dsn1 278. A quantitative MS-based approach combined with selective enrichment of kinetochore particles or subcomplexes of the more elaborate human kinetochore might aid in the identification of novel MPS1 substrates, as was previously shown for KNL1 in budding yeast 118. Similar strategies can be envisioned for the APC\/C and MCC complex as well as the KMN network, CCAN proteins and, for instance, the SKA-complex. Elucidating which of the undoubtedly many candidate phosphorylations identified in this way are truly done by MPS1 will be greatly aided by the recent identifications of the MPS1 consensus phosphorylation motif 239,279 that closely resembles the sequence surrounding the MPS1 targets in the bona fide substrate KNL1 67,118-120.\n\nAuxiliary checkpoint proteins\nIn Chapter 4 we investigated if the activity of the SAC depends on the presence or activity of so called auxiliary, or modulating, proteins. We previously identified Aurora B as such a modulating protein. The role of Aurora B in SAC regulation is not an essential one since SAC maintenance is not significantly affected by depletion or inactivation of Aurora B. Aurora B is only required for timely establishment of the SAC by promoting efficient recruitment of MPS1 to unattached kinetochores at the onset of mitosis 146,153,212. The role of Aurora B in the SAC is therefore auxiliary and only revealed in a sensitized SAC assay 146,212. Like Aurora B, PLK1 activity is not essential for SAC maintenance when it is fully activated, but becomes essential to maintain a mitotic arrest when SAC activity is low. A role for PLK1 in the SAC has been tentatively proposed 226 but has remained unclear. This is perhaps due to the fact that PLK1 acts as an auxiliary factor combined with its essential role in a multitude of other mitotic processes, inhibition of which prominently activate the SAC 224,225,227,228. In contrast to Aurora B, PLK1 does not influence MPS1 kinetochore localization in human cells, as was recently suggested in Drosophila cells 228. Instead, we show that PLK1 regulates checkpoint activity downstream of MAD1 and serves to promote MCC stability when SAC activity is low. Although future experiments need to elucidate the exact mechanism by which PLK1 promotes MCC stability, our data suggests that phosphorylation within the BUBR1 GLEBS motif might be an important factor, by promoting the BUBR1-BUB3 interaction. If so, BUBR1 is a focal point for PLK1 signaling at the kinetochore: It was recently shown that PLK1 phosphorylates BUBR1 in another motif termed the KARD, promoting a BUBR1-PP2A interaction that is required for stabilizing kinetochore-microtubule interactions 41,42.\n\nOur sensitized SAC assay is a powerful tool to examine SAC modulating factors, as shown by our identification of Aurora B and PLK1 as auxiliary components of the SAC. Besides allowing functional analysis of these two kinases in the SAC, we show in Chapter 3 that the sensitized SAC assay enhances the checkpoint phenotypes of ZW10 and BUB1 RNAi, proteins that are difficult to deplete efficiently. This may also hold true for NDC80 depletion, and the sensitized SAC assay has been instrumental in determining its contribution and that of its CH domain to SAC signaling 142. Future investigations using this sensitized set up might yield more auxiliary SAC regulators and might aid the study of essential regulators that have proven difficult to functionally inactivate. For instance, depletion of MAD1 has proven difficult and has obstructed the investigation of MAD1 phosphorylations that we identified in Chapter 5. Combining the described MAD1 phosphomutants with the sensitized SAC assay might allow functional studies, and this will be a subject of future studies.\n\nFeedback in the SAC\nCorrect regulation of many cellular processes is controlled by feedback networks that enable cellular mechanism to rapidly respond to changing stimuli. The decision to enter mitosis for instance, is mediated by a network of several feedbacks loops that correctly regulate the activation of the Cyclin B-CDK1 complex to ensure that once the commitment to cell division is made, it is executed rapidly and robustly 3. A snowballing amount of evidence suggests that SAC regulation also depends on multiple feedback mechanisms. We previously showed that timely establishment of MPS1 kinetochore localization depends on Aurora B 146. Activity and localization of Aurora B in turn is regulated by MPS1 through direct phosphorylation of Borealin and promoting BUB1-dependent histone H2A phosphorylation respectively 132,151,153,164,191,192. MPS1 and Aurora B are thus engaged in a positive feedback loop ensuring rapid establishment of both the SAC and the error correction mechanisms as cells enter mitosis (Figure 1).\n\nIn Chapter 3 we identify feedback control in the regulation of MAD1 kinetochore binding. MPS1 recruitment of MAD1 is mediated by BUB1 and ZW10. BUB1 regulates ZW10 localization, and ZW10 in turn recruits MAD1 while simultaneously facilitating KMN network stability consequently regulating MPS1 localization. Feedback regulation thus ensures rapid activation and subsequent maintenance of the SAC by promoting MPS1-dependent MAD1 kinetochore binding (Figure 6.1). Although not fully recognized, other feedback mechanisms involving MPS1 are easily envisioned. By promoting MCC formation and stability 90,91,151, MPS1 guarantees high Cyclin B-CDK1 activity, which in turn promotes MPS1 activity by direct phosphorylation 280. The involvement of MPS1 in MCC stability might also be subjected to feedback regulation, for instance by regulation of a phosphatase, p31 comet or the APC\/C as mentioned above. Lastly, it has been shown that MPS1 promotes PLK1 kinetochore binding 91. Since in Chapter 4 we show that MCC stability requires PLK1 activity, it might thus be possible that an additional feedback loop regulates MCC stability. We suspect that the multitude of feedback loops in SAC regulation provides timely establishment of SAC signaling as cells enter mitosis, while also enabling the SAC to rapidly respond to kinetochore attachment status and ensuring rapid inactivation of the SAC once all kinetochores have attached. Although technically challenging, it will therefore be interesting to address whether feedback loops, like the Aurora B - MPS1 feedback, is essential to maintain SAC signaling when only few unattached kinetochores remain, while the same feedback might simultaneously function in the rapid extinguishing of SAC signaling once the last kinetochore has attached. Since MPS1 plays a central role in various SAC feedbacks, small alterations in its activity or expression might have drastic effects on genome stability and result in aneuploidy. Future studies investigating the consequence of minor alterations in MPS1 activity or expression on genome stability in cells and mouse models can provide more insight in the contribution of the SAC to chromosomal instability and cancer.\n\nMPS1 Aurora B MAD1 ZW10 BUB1 KMN network PLK1 MCC\n\nFigure 6.1. MPS1-centered feedback loops control the SAC\nSchematic representation of various feedbacks that regulate SAC signaling and error correction. The first feedback loop between Aurora B and MPS1 (green) ensures timely establishment of both SAC signaling and error correction. The second feedback control between MPS1, BUB1 and ZW10 (blue) promotes MAD1 localization. The third, and more elaborate, feedback regulates MCC production and stability (red). In this feedback, MPS1 activity is required for MCC production through MAD1 localization while simultaneously ensuring PLK1 kinetochore localization, which is required for MCC stability when SAC signaling is low.","auteur":"Tale Sliedrecht","auteur_slug":"tale-sliedrecht","publicatiedatum":"3 december 2013","taal":"NL","url_flipbook":"https:\/\/ebook.proefschriftmaken.nl\/ebook\/talesliedrecht?iframe=true","url_download_pdf":"","url_epub":"","ordernummer":"FTP-202604101014","isbn":"","doi_nummer":"","naam_universiteit":"Universiteit Utrecht","afbeeldingen":12312,"naam_student:":"","binnenwerk":"","universiteit":"Universiteit Utrecht","cover":"","afwerking":"","cover_afwerking":"","design":""},"_links":{"self":[{"href":"https:\/\/www.proefschriftmaken.nl\/en\/wp-json\/wp\/v2\/us_portfolio\/11017","targetHints":{"allow":["GET"]}}],"collection":[{"href":"https:\/\/www.proefschriftmaken.nl\/en\/wp-json\/wp\/v2\/us_portfolio"}],"about":[{"href":"https:\/\/www.proefschriftmaken.nl\/en\/wp-json\/wp\/v2\/types\/us_portfolio"}],"author":[{"embeddable":true,"href":"https:\/\/www.proefschriftmaken.nl\/en\/wp-json\/wp\/v2\/users\/8"}],"replies":[{"embeddable":true,"href":"https:\/\/www.proefschriftmaken.nl\/en\/wp-json\/wp\/v2\/comments?post=11017"}],"version-history":[{"count":1,"href":"https:\/\/www.proefschriftmaken.nl\/en\/wp-json\/wp\/v2\/us_portfolio\/11017\/revisions"}],"predecessor-version":[{"id":11020,"href":"https:\/\/www.proefschriftmaken.nl\/en\/wp-json\/wp\/v2\/us_portfolio\/11017\/revisions\/11020"}],"wp:featuredmedia":[{"embeddable":true,"href":"https:\/\/www.proefschriftmaken.nl\/en\/wp-json\/wp\/v2\/media\/12312"}],"wp:attachment":[{"href":"https:\/\/www.proefschriftmaken.nl\/en\/wp-json\/wp\/v2\/media?parent=11017"}],"wp:term":[{"taxonomy":"us_portfolio_category","embeddable":true,"href":"https:\/\/www.proefschriftmaken.nl\/en\/wp-json\/wp\/v2\/us_portfolio_category?post=11017"}],"curies":[{"name":"wp","href":"https:\/\/api.w.org\/{rel}","templated":true}]}}