{"id":10849,"date":"2026-04-10T08:25:52","date_gmt":"2026-04-10T08:25:52","guid":{"rendered":"https:\/\/www.proefschriftmaken.nl\/portfolio\/stephanie-gumbs\/"},"modified":"2026-04-23T07:13:04","modified_gmt":"2026-04-23T07:13:04","slug":"stephanie-gumbs","status":"publish","type":"us_portfolio","link":"https:\/\/www.proefschriftmaken.nl\/en\/portfolio\/stephanie-gumbs\/","title":{"rendered":"Stephanie Gumbs"},"content":{"rendered":"","protected":false},"excerpt":{"rendered":"","protected":false},"author":8,"featured_media":12408,"comment_status":"closed","ping_status":"closed","template":"","meta":{"_acf_changed":false,"footnotes":""},"us_portfolio_category":[45],"class_list":["post-10849","us_portfolio","type-us_portfolio","status-publish","has-post-thumbnail","hentry","us_portfolio_category-new-template"],"acf":{"naam_van_het_proefschift":"Investigation of the central nervous system as a viral reservoir for HIV","samenvatting":"Sinds de introductie van antiretrovirale therapie (ART) is een infectie met het humaan immunodefici\u00ebntie virus (hiv) in de meeste gevallen een chronische aandoening, met een normale levensverwachting. Behandeling van hiv is erop gericht om de hoeveelheid virus in het lichaam (virale load) te onderdrukken tot ondetecteerbare waarden door het vermenigvuldigen (replicatie) van het virus te voorkomen. Echter, ondanks langdurige behandeling, is ART niet in staat om hiv te genezen. Dit komt omdat het virus zich, direct na infectie, nestelt in het DNA van onze afweercellen waarin het \u201cslapend\u201d aanwezig blijft, het zogenaamd latent viraal reservoir. ART verhindert de infectie van nieuwe cellen, maar kan deze reservoircellen niet verwijderen. Hierdoor dient ART levenslang te worden voortgezet om te voorkomen dat het reservoir \u201cwakker\u201d wordt (reactiveert) en in afwezigheid van ART weer nieuw infectieus virus produceert (virale rebound). De genezing van hiv berust dus op het vermogen om deze ge\u00efnfecteerde reservoircellen te verwijderen of de productie van nieuw infectieus virus permanent te blokkeren.\n\nHet is bekend dat hiv zich ook in de hersenen nestelt. Maar hoe, waar precies en wat het volledige gevolg is, is nog onduidelijk. De hersenen vormen samen met het ruggenmerg het centrale zenuwstelsel (CZS), een uniek anatomisch compartiment dat beschermt wordt door de bloed-hersenbarri\u00e8re (BBB) en omgeven is door hersenvocht (CSF). De persistentie van hiv in het CZS draagt bij tot de ontwikkeling van een spectrum van cognitieve stoornissen die gezamenlijk hiv-geassocieerde neurocognitieve stoornis (HAND) wordt genoemd. Ondanks langdurige behandeling treedt bij 20-50% van de hiv-ge\u00efnfecteerd populatie nog steeds HAND op, waarvan de meeste een milde vorm hebben.\n\nIn dit proefschrift leveren we bewijs ter ondersteuning van het CZS als een viraal reservoir voor hiv. Hiervoor hebben we gebruik gemaakt van verschillende kweekmodellen en technieken om hiv-infectie in het CZS te onderzoeken. Eerst beschrijven we in hoofdstuk 2, een overzicht van kweekmodellen die gebruikt kunnen worden om hiv-infectie in het CZS en met name in de microglia cellen te onderzoeken. In de daaropvolgende hoofdstukken leveren we bewijs ter ondersteuning van het CZS als viraal reservoir, waaronder de verschillen tussen de virus populatie in hersenvocht en bloed (hoofdstuk 3), detectie van intact hiv-DNA in hersenweefsel gedurende langdurige ART (hoofdstuk 4), en het ontrafelen van de target cellen van hiv in de hersenen (hoofdstuk 5). Als laatst geven we in hoofdstuk 6 een overzicht van de huidige literatuur over hiv-genezing strategie\u00ebn en impact op het CZS viraal reservoir.\n\nHiv en de CZS\nBij het binnendringen van het lichaam gaat het virus op zoek naar target cellen die een CD4 receptor en een hulp receptor, CCR5 of CXCR4, aan de buitenkant van de cel tot expressie brengen. Het virus gebruikt deze twee receptoren als een soort antenne om aan de cel te binden en vervolgens te infecteren. In het bloed infecteert hiv voornamelijk CD4 positieve T-lymphocyten, kortweg CD4-cellen. Door de CD4-cellen te gebruiken als een soort kopieermachine, kan hiv zichzelf vermenigvuldigen en vervolgens een groot aantal nieuwe virussen verspreiden door het lichaam waaronder naar het centrale zenuwstelsel.\n\nKort na de primaire infectie, dringt hiv de hersenen binnen. In hoofdstuk 3 hebben we de hoeveelheid virus (virale load) in bloed en hersenvocht van mensen met hiv die niet op behandeling zijn geanalyseerd en vonden dat in de meeste individuen (84%) de virale load in het hersenvocht significant lager is dan in het bloed. Hiernaast vonden we 3 individuen die meer virus in het hersenvocht hadden dan in het bloed. Deze bevindingen duiden erop dat de toegang van hiv naar de hersenen selectief is en dat waarschijnlijk ook hiv-productie en\/of replicatie in de hersenen plaatsvindt.\n\nHet is bekend dat twee celtypes in de hersenen, namelijk microglia en perivasculaire macrofagen, de CD4 receptor en de hulp receptor CCR5 tot expressie brengen. Hierdoor zijn deze cellen, naast de vanuit het bloed infiltrerende CD4-cellen de meest waarschijnlijke target cellen in het CZS die door hiv ge\u00efnfecteerd kunnen worden. In post-mortem (na de dood) hersenonderzoek van hiv-positieve individuen wordt hiv-DNA ook het vaakst aangetroffen in deze microglia en perivasculaire macrofagen. Deze cellen hebben een lange halfwaardetijd van ongeveer 3 maanden (macrofagen) tot 4.2 jaar (microglia). Microglia zijn, in tegenstelling tot macrofagen, een zelfvoorzienende populatie en hebben hiernaast ook speciale mechanismen om het virus in slaap, oftewel latent, te houden. Hierdoor zou hiv voor een lange tijd in de hersenen kunnen overleven. Naast microglia en perivasculaire macrofagen worden astrocyten ook verdacht vatbaar te zijn voor hiv-infectie hoewel dit in het hiv onderzoeksveld controversieel is, omdat astrocyten geen CD4 receptor tot expressie brengen.\n\nHelaas is het zelden mogelijk om humaan hersenweefsel direct te bestuderen, voornamelijk omdat het moeilijk is om vers humaan hersenweefsel te krijgen. Hierdoor gingen we in hoofdstuk 2 op zoek naar een humaan microglia kweek model dat geschikt is voor hiv-onderzoek. We hebben onderzocht hoe goed de verschillende modellen in staat zijn om de echte microglia zoals verkregen uit hersenweefsel na te bootsen en of ze een productieve hiv-infectie kunnen ondersteunen. Onder productieve hiv-infectie verstaan we het vermogen van een cel om ge\u00efnfecteerd te raken en vervolgens nieuwe infectieuze virussen te produceren. Tot voor kort, werd microglia-onderzoek doorgaans uitgevoerd op microglia cellijnen, monocyten-afgeleide microglia (MDMi) en ge\u00efsoleerde microglia uit humaan hersenweefsel, de zogenaamde primaire microglia (pMG). Recente technologische vooruitgang in stamcelonderzoek heeft de functionele modellering van de humane hersenen mogelijk gemaakt door het omzetten van stamcellen tot een verscheidenheid van hersencellen, waaronder microglia (iPSC-MG) en 3D cerebrale organo\u00efden.\n\nWij vonden dat hoewel elk microglia kweekmodel, behalve de microglia cellijnen, verschillende aspecten van de celstructuur en de functie van microglia kan repliceren, geen enkel kweekmodel in staat is om de echte microglia in de hersenen volledig na te bootsen. Desondanks vonden we dat primaire microglia, monocyten-afgeleide microglia en cerebrale organo\u00efden productieve hiv-infectie ondersteunen met behulp van de CD4 receptor en de CCR5 hulpreceptor die op alle 3 kweekmodellen tot expressie komt. In tegenstelling tot primaire microglia en monocyten-afgeleiden microglia, was de infectie in cerebrale organo\u00efden beperkt met weinig virale spreiding en is hierdoor het meest representatief voor hiv-infectie in de hersenen. Al met al, zijn primaire microglia, monocyten-afgeleide microglia en cerebrale organo\u00efden, op basis van onze bevindingen, allemaal geschikte microglia kweekmodellen voor hiv-onderzoek hoewel cerebrale organo\u00efden en ook de infectie hiervan de meeste gelijkenissen vertonen met de echte infectie van microglia in de hersenen.\n\nHiv infectie in de CZS\nNa het bepalen van het beste kweekmodel hebben we in hoofdstuk 5 de cerebrale organo\u00efden gebruikt om te onderzoeken welke hersencellen, naast microglia, mogelijk vatbaar zijn voor productieve hiv-infectie. 3D cerebrale organo\u00efden worden vaak mini-breintjes genoemd, wat suggereert dat het om kleine versies van de complexe menselijke hersenen gaat. In werkelijkheid, zijn de humane hersenen te complex om volledig na te bootsen in een laboratorium. Echter de cerebrale organo\u00efden zijn kleine 3D hersenstructuren (2 tot 5mm groot) die een grote verscheidenheid van hersencellen waaronder microglia, astrocyten en neuronen laten zien, die zich structureel organiseren zoals in de ontwikkelende hersenen tijdens de zwangerschap. Door deze cerebrale organo\u00efden te infecteren met een hiv-virus met een fluorescentie label, konden we vaststellen welke cellen ge\u00efnfecteerd raakten door de fluorescentie onder de microscoop te visualiseren. Het enige celtype dat productief door hiv ge\u00efnfecteerd kon worden, waren de microglia. Hiernaast waren er ook verschillende overeenkomsten tussen hiv-infectie in de cerebrale organo\u00efden en hiv-infectie in de hersenen, waaronder beperkte infectie, weinig virale spreiding en de typische grote microglia complexe celstructuren die vaak gezien wordt in het hersenweefsel van hiv-positieve individuen met hiv-geassocieerde dementia en encefalitis.\n\nHoewel we nu overtuigend bewijs hebben dat microglia het hoofddoelwit van hiv in de hersenen is, is er \u00e9\u00e9n kenmerkend verschil tussen de distrubutie van de CD4 en de CCR5 receptor op microglia en CD4-cellen in bloed. Vergeleken met de CD4 positieve T cellen, is de dichtheid van de CD4 en CCR5 receptoren aan de buitenkant van microglia veel lager. Hierdoor wordt het verondersteld dat, tijdens chronische hiv-infectie, de virussen afkomstig van het bloed zich genetisch aanpassen aan de lage oppervlaktedichtheid van de hiv receptoren op microglia om ze vervolgens effectief te kunnen infecteren. In hoofdstuk 3 hebben we in een groep van hiv-positieve individuen die niet op behandeling stonden, onderzocht of er genetische verschillen zijn tussen virussen in het bloed en virussen in het hersenvocht. Hiernaast we gekeken hoe goed deze virussen CD4-cellen en microglia infecteren. Uit onze studiepopulatie bleek dat er over het algemeen weinig genetische verschillen zijn tussen de viruspopulaties in hersenvocht en bloed in de meeste individuen, maar bij twee individuen vonden we dat de viruspopulatie in het hersenvocht aanzienlijk verschilde van de viruspopulatie in het bloed. Dit noemen we compartmentalizatie. De detectie van CZS compartmentalizatie in deze twee individuen duidt erop dat er hoogstwaarschijnlijk niet alleen hiv-infectie maar ook replicatie plaatsvond in hersencellen, dat leidde tot de productie van deze CZS-specifieke virussen. Daarnaast, hoewel alle virussen de CD4-cellen konden infecteren, waren de meeste virussen niet in staat om microglia te infecteren. Dit suggereert dat deze CZS-specifieke virussen waarschijnlijk geproduceerd zijn door T cellen in het CZS. Echter waren er wel enkele virussen die het redelijk goed deden in microglia. Het is nog de vraag of deze virussen tussenproducten zijn op weg naar de transformatie tot virussen die effectief microglia kunnen infecteren.\n\nHet CZS als een hiv-reservoir\nKortom, de bovengenoemde studies leveren samen bewijs voor hiv-infectie en replicatie in het CZS, maar om vast te stellen dat het CZS een hiv-reservoir is hebben we hard bewijs nodig van ge\u00efnfecteerde reservoircellen in de hersenen die na reactivatie in staat zijn om nieuwe virussen te produceren die ook weer nieuwe cellen kunnen infecteren. Om kopie\u00ebn van zichzelf te kunnen maken moet eerst het RNA van hiv ingebouwd worden in het DNA van de cel. Hiervoor gebruikt hiv twee virale eiwitten (enzymen) namelijk reverse-transcriptase, die het viraal RNA omzet in viraal DNA, en integrase die ervoor zorgt dat het virale DNA ingebouwd wordt in het DNA van de cel. Reverse transcriptase maakt constant fouten tijdens het omzetten van RNA in DNA, waardoor het meeste hiv-DNA in CD4-cellen defect is en geen nieuw infectieus virus kan produceren.\n\nVoorgaande post-mortem studies hebben stukjes hiv-DNA aangetoond in de hersenen, voornamelijk in microglia en macrofagen, maar om beschouwd te worden als een onderdeel van het hiv-reservoir moet dit hiv-DNA intact zijn. In hoofdstuk 4 kijken wij naar de integriteit van hiv-DNA in hersencellen ge\u00efsoleerd uit een individu met hiv op langdurige behandeling (post-mortem). Hiervoor hebben we een nieuwe techniek toegepast, genaamd IPDA (intact proviral DNA assay), waarmee we een onderscheid kunnen maken tussen intact en defect hiv-DNA. Zoals verwacht was alleen een klein deel van het totale hiv-DNA intact (13%), maar de prevalentie van intact DNA was ongeveer 2.8-voud hoger in microglia dan in de resterende hersencellen. Dit levert verder bewijs op dat microglia de meest waarschijnlijke reservoircel voor hiv in het CZS is, maar wijst erop dat ook andere celtypes intact hiv-DNA zouden kunnen hebben en mogelijk kunnen fungeren als een reservoir. Het is nog de vraag of deze reservoircellen met intact hiv-DNA ook in staat zijn om na reactivatie nieuw infectieus virus te produceren die vervolgens bijdraagt aan virale rebound. Om hier inzicht in te krijgen hebben we een belangrijk onderdeel van het hiv-DNA verder onderzocht. Dit is het zogenaamde virale envelop eiwit, dat verantwoordelijk is voor het binden van het virus aan de hiv receptoren op de cel. We vonden dat het envelop stuk van de virussen, ge\u00efsoleerd uit de bovengenoemde microglia hersencellen, intact is en effectief konden binden aan de CD4 en CCR5 receptor van CD4-cellen. Na binding, kon het virus de cel binnendringen, zichzelf inbouwen in het DNA van de CD4-cel en vervolgens nieuwe infectieus virus aanmaken. Dit preliminaire experiment ondersteunt het potentieel van microglia-specifieke virussen om naast virale rebound in het CZS ook bij te dragen aan de virale rebound in het bloed door infectie en replicatie in (perifere) CD4-cellen.\n\nHiv genezing en het CZS reservoir\nHiv is helaas nog niet globaal te genezen. Wereldwijd zijn er 4 mensen genezen van hiv na het ondergaan van een stamceltransplantatie. Helaas kan stamceltransplantatie niet op grote schaal gebruikt worden als genezing voor hiv omdat de kans op overlijden bij een stamceltransplantatie erg groot is. Het hoofddoel van hiv-genezing strategie\u00ebn is om hiv-positieve individuen in staat te stellen hun hiv-therapie te staken zonder de gevolgen van virale rebound en de daaropvolgende opportunistische infecties die uiteindelijk leiden tot AIDS.\n\nNaast stamceltransplantatie worden er verschillende manieren onderzocht om het slapende virus te verwijderen uit het lichaam en\/of permanent te onderdrukken. Twee van de meest veelbelovende hiv-genezing strategie\u00ebn zijn de \u201cBlock and Lock\u201d en de \u201cShock and Kill\u201d strategie. De block and lock strategie heeft tot doel om ge\u00efnfecteerde reservoircellen permanent in een diepe slaap te vergrendelen (lock) om reactivatie en nieuwe virus productie te voorkomen (block). De shock and kill strategie, daarentegen, is de meest onderzochte strategie voor hiv-genezing en berust op het reactiveren van de ge\u00efnfecteerde reservoircellen (shock), zodat ze herkent en opgeruimd kunnen worden door het immuunsysteem (kill).\n\nIn hoofdstuk 6 hebben we uitvoerig de shock and kill strategie besproken met betrekking tot eradicatie van het CZS reservoir. Het succes van deze strategie bij de eradicatie van het CZS reservoir is sterk afhankelijk van het vermogen om de reservoircellen in de hersenen effici\u00ebnt te activeren zonder gevaarlijke inflammatie en toxiciteit in de hersenen te veroorzaken. Even belangrijk is het binnendringen van immuuncellen vanuit het bloed in het CZS om effectief de geactiveerde reservoircellen op te ruimen. Tot nu toe is uit onderzoek gebleken dat het mogelijk is om een deel van de slapende virussen in het reservoir te reactiveren, maar helaas is het nog niet gelukt om het virus hierna uit te schakelen en het viraal reservoir te verkleinen. Momenteel wordt er onderzoek gedaan om te kijken hoe we de reactivatie van de reservoircellen kunnen optimaliseren en het immuunsysteem versterken om het virus beter op te ruimen.\n\nConclusie\nIn dit proefschrift, leveren we sterke aanwijzingen dat het CZS kan functioneren als een viraal reservoir voor hiv. Wij hebben de microglia ge\u00efdentificeerd als het hoofddoelwit van hiv in de hersenen, CZS-specifieke virussen gevonden die aanzienlijk verschilde van de virussen in het bloed en in het bijzonder voor het eerst intact hiv-DNA aangetoond in post-mortem verkregen hersencellen van iemand met hiv die langdurig antiretrovirale behandeling had ondergaan.\n\nOp basis van voorgaande studies zoals beschreven in de wetenschappelijke literatuur, in combinatie met onze eigen bevindingen, zijn we overtuigd dat microglia de voornaamste reservoircel is voor hiv in het CZS en ongetwijfeld een belangrijke rol speelt in het bereiken van hiv genezing. Om CZS te betrekken bij strategie\u00ebn voor genezing van hiv, hebben wij een uitgebreid begrip nodig van de moleculaire mechanismen die verantwoordelijk zijn voor het vormen en behouden van hiv in de slaapstand in deze cellen. Hiervoor kunnen we de verschillende microglia kweekmodellen gebruiken, waaronder primaire microglia, monocyten-afgeleide microglia en 3D cerebral organo\u00efden, benoemd in hoofdstuk 2. Tenslotte bevelen wij aan om CZS-monitoring toe te voegen aan lopende en toekomstige klinische studies gericht op de genezing van hiv om mogelijke schadelijke neveneffecten op het CZS te beperken en tegelijkertijd meer inzicht te krijgen in het CZS viraal reservoir.","summary":"Furthermore, as the IPDA does not measure replication competence, it remains to be studied how much of the intact proviral reservoir in the CNS is inducible and can fuel rebound viremia following in vivo activation or stimulation. In chapter 4, we generated CNS-derived luciferase reporter viruses, utilizing the full-length Env gene amplified from the microglia fraction, and showed that the Env gene derived from microglia can efficiently replicate within CD4+ T cells, hereby supporting the potential of CNS-derived viruses to reseed viremia in the periphery.\n\nCNS culture models to study neuroHIV\nTo officially designate the CNS as an HIV reservoir, proof of replication competence is required. The CNS resident cells need to be able to support viral replication while the intact proviral DNA needs to encode for a replication-competent virus capable of productively infecting local CNS cells. Due to the inaccessibility and scarcity of human brain tissue, however, this is an extremely challenging undertaking primarily due to the ethical and practical restrictions. Non-human primates (NHP) share similar anatomical and physiological features to humans and have been well-established as a human surrogate for the investigation of HIV-1 pathogenesis [53].\n\nHistorically, early models of neuroAIDS research typically utilized different viral clones or swarms, that target both CD4+ T cells and monocyte\/macrophages, causing AIDS-like immunosuppression and SIV encephalitis (SIVE) in about 30% of Rhesus macaques and higher percentages of Pigtailed macaques within 2-3 years [54\u201357]. Since then, several NHP models have been developed that reliably develop AIDS with a high incidence of SIVE within 3 to 6 months after infection. Rapid AIDS progression is induced through inoculation of Rhesus or pigtailed macaques with neurovirulent or macrophage-tropic viruses combined with the suppression or depletion of either CD4+ or CD8+ T cells using immunosuppressive viruses or monoclonal antibodies [54,55,57]. SIV infection, albeit accelerated, was found to mirror many of the key pathophysiological features of HIV infection in humans [54\u201357]. It is nonetheless noteworthy that NHP have significant genetic and physiological differences from humans and thus caution should be taken when translating results to the in vivo scenario in humans.\n\nThis being said, some of the most prominent CNS findings were obtained using the rapid neuroAIDS SIV models, including proof of a macrophage functional latent reservoir. Using a macrophage-specific quantitative viral outgrowth assay (M\u03a6-QVOA), CD11b+ brain macrophages (microglia and perivascular macrophages) were found to harbor replication-competent SIV in macaques suppressed on ART for 4 months up to 1.5 years [58\u201360]. In addition, viruses induced in the M\u03a6-QVOA were able to infect and propagate normally in healthy activated CD4+ T cells [58\u201360]. These studies hereby provide solid evidence that CD11b+ brain macrophages, in macaques, satisfy all the criteria of an HIV reservoir.\n\nYet, while the use of NHP provides many practical benefits over human studies including experimentally controlled infection and ART regimen, sampling of brain tissue, and the possibility to perform longitudinal analyzes, it is expensive and increasingly restricted by serious ethical concerns for the primates [53,55]. Current legislation and public opinion progressively push for an end to the use of animals for scientific research, especially NHP. As one of the partners in the national Non-animal Testing Innovation Transition (TPI) initiative, ZonMw started a program in 2021 entitled \u201cMore Knowledge with Fewer Animals\u201d that provides funding for research into the development and implementation of animal-free models (chapter 2 and 5).\n\nIn chapter 4, we utilized the well-characterized primary CD4+ T-cell culture model to prove that full-length Env genes found in human microglial cells are replication-competent and can refuel viremia in the periphery (CD4+ T cells). However, we also need human CNS culture models that resemble the human CNS in vivo to further research on HIV infection in the CNS.\n\nIn chapter 2, we interrogated a variety of human microglial culture models on their resemblance to microglia in vivo, on a morphologic, transcriptomic, and functional level, and their ability to support productive HIV infection. Except for the microglial cell lines, each model was able to recapitulate aspects of primary microglia morphology and function however none of the models were able to fully recapitulate the transcriptomic signature of uncultured primary microglia. Several research groups have somewhat rectified this transcriptomic deficiency by adapting the cytokine cocktail in the culture medium, co-culture with astrocytes and\/or neurons, or transplantation in mice, however complete correction remains an ongoing undertaking. Based on their transcriptome, cerebral organoids and iPSC-derived microglia have the closest resemblance to cultured primary microglia. In terms of HIV replication, we found the SV4O and HMCP cell lines to be resistant to HIV infection and observed a significant difference in infection pattern between the commonly used microglial models, primary microglia (pMG) and monocyte-derived microglia (MDMi), and the cerebral organoid model. pMG and MDMi were highly susceptible to HIV replication with continuous virus production and viral spread, and thus not reflective of the limited infection and viral spread observed among microglial cells in vivo. HIV infection of organoid-derived microglia and cerebral organoids, in contrast, reached peak infection in the first week of infection with limited viral spread within the organoids. This observation somewhat aligns with a recent study by Alvarez-carbonell et al [61], that observed co-culture with neurons to have an initial inhibitory effect on microglia infection, suggesting that the surrounding CNS cells play a role in the infection of microglia in vivo either through direct cell-to-cell contact or indirect communication via the release of cytokines and\/or chemokines. Overall, based on our findings we found cerebral organoids to have the closest resemblance to (cultured) primary microglia and most representative of microglia HIV infection in vivo.\n\nIn the cerebral organoid model, consisting of a variety of CNS cells including microglia, astrocytes, and neurons, we found that productive HIV infection occurred exclusively within microglial cells via the CCR5 receptor (chapter 5). A similar finding was reported by Dos reis et al., following the incorporation of HIV-infected microglia into their human brain organoid (hBORG) model [62]. Furthermore, despite the detection of HIV DNA and msRNA in astrocytes in vivo [26], neither organoid model found astrocytes to be susceptible to productive HIV infection. A very recent paper by Woodburn et al [63], also reported that, contrary to primary microglia and monocyte-derived macrophages, astrocytes were completely refractory to HIV infection using both M-tropic and T cell-tropic HIV-1 Env proteins. Albeit, the absence of HIV infection in astrocytes in our organoid model may be explained by two notable limitations of our organoid model, namely the \u201cage\u201d of the astrocytes and the absence of CD4+ T cells. Immature astrocytes might be less susceptible to HIV infection than fully mature astrocytes in older organoids, whereas CD4+ T cells are proposed to be essential for CD4-independent infection of astrocytes in vitro.\n\nOverall, the cerebral organoid model holds great promise as a human CNS-like in vitro culture model for the study of HIV neuropathogenesis, including the establishment, maintenance, and reactivation of HIV latency in the CNS. Notably, as with any in vitro model, it comes with a set of limitations. Some of the biggest challenges we came across while setting up the cerebral organoid model for HIV research were: (i) the high variability between organoids from the same batch and across iPSC lines, (ii) the lack of control over mesoderm induction and the subsequent low frequency of microglia within the organoids (iii) and the inability to completely remove unbound virus from the Matrigel. Since the publication of our organoid differentiation protocol in 2018 [64], there have been considerable improvements in the protocols used for the generation of cerebral organoids such as the replacement of Matrigel with polymer scaffolds and adapting the differentiation cocktail to decrease heterogeneity and improve reproducibility. One protocol that piqued our interest was published by Xu et al. and entails the co-culture of iPSC-derived primitive macrophage progenitors and primitive neural progenitor cells at the onset of 3D organoid formation to generate microglia-containing brain organoids and hereby gain control of the frequency of microglia within the organoids [65]. Furthermore, as the cerebral organoid technology field continues to advance to better recapitulate the human CNS in vitro, it also gives rise to various ethical concerns [66]. Particularly, one can wonder whether a human cerebral organoid could develop some degree of consciousness and whether, under certain conditions, it could acquire its own moral status with the related rights [67].\n\nLastly, cerebral organoids have been proposed as an alternative model for animal research. Currently, the development of cerebral organoids utilizes several animal-derived components, such as sera and Matrigel. Furthermore, cerebral organoids lack interorgan communication, do not contain a blood-brain barrier, and lack peripheral immune cells all of which are essential for the accurate representation of CNS HIV infection in vivo. As a result, cerebral organoids cannot completely replace the use of animals in HIV research but can be used as a pre-screening tool to help reduce the number of animals used.\n\nTargeting the HIV reservoir\nThe main objective of cure interventions is to enable HIV-infected individuals to discontinue treatment without the consequence of rebound viremia and the ensuing opportunistic infections. The achievement of a sterilizing HIV cure in the \u201cBerlin patient\u201d, and the recent \u201cLondon patient\u201d, as well as the \u201cDusseldorf patient\u201d, have given new hope that a cure for HIV is possible [68\u201371]. These patients underwent an allogeneic stem cell transplant from a homozygous CCR5 32 donor, whose cells are resistant to R5-tropic HIV variants due to the 32-base pair deletion in the CCR5 receptor. There have been several attempts to replicate the success of the \u201cBerlin patient\u201d, which included the \u201cBoston patients\u201d who received an allogeneic stem cell transplant from homozygous wildtype CCR5+\/+ donors. Both patients remained HIV negative up until 129- and 226-days after ART interruption, when the virus rebounded in blood and CSF, resulting in HIV-associated meningitis in one patient [72].\n\nOn a positive note, the achievement of a cure following the transplantation of CCR5 32 stem cells has prompted research into gene editing to develop HIV-1 resistant cells. This included the use of a variety of nuclease-mediated gene editing tools, such as transcription activator-like effector nucleases (TALEN), zinc-fingers (ZNF), and clustered regularly interspaced short palindromic repeats (CRISPR) to manipulate the CCR5 and CXCR4 receptor in vitro, however, due to the high-cost and time-consuming process of ZNF and TALEN, CRISPR\/Cas9 has become the preferred method [73]. The CRISPR\/Cas9 system involves the use of a custom-designed guide RNA and the Cas9 nuclease to excise a specific DNA sequence from a cell, such as CCR5, or HIV DNA, to generate cells that are devoid of these sequences [74,75]. The CRISPR\/Cas9 system can also be used to reactivate latently infected cells or suppress HIV expression by fusing an activator or repressor to a defective Cas9 (dCas9) protein [76]. Using the CRISPR system, latent HIV could be successfully eradicated from microglia [77], perivascular macrophages [77], and astrocytes [78] in vitro, suggesting that this method could be an effective strategy for targeting the CNS. However, it remains to be established whether CRISPR can effectively cross the BBB and have the same impact on these CNS cells in vivo.\n\nIn addition to gene therapy, there are two pharmacological approaches to HIV cure namely, the \u201cShock and Kill\u201d and the \u201cBlock and Lock\u201d strategy. The Shock and Kill strategy, extensively discussed in chapter 6, is the most explored strategy for HIV cure and entails the reactivation of the latent reservoir with potent latency-reversing agents (LRA), followed by cell killing either directly due to the cytopathic effect of the virus or by cell-mediated immune responses [79]. The success of this method in the eradication of the CNS reservoir is highly dependent on the ability of the LRAs to cross the BBB and efficiently activate all the latently infected CNS cells without causing overt neuroinflammation and neurotoxicity. Equally important is the penetration of immune cells and\/or neutralizing antibodies into the CNS and their efficacy in killing the activated reservoir [80].\n\nThe \u201cBlock and Lock\u201d strategy, in contrast, aims to permanently lock infected cells into a deep latent state and prevent HIV gene transcription using latency-promoting agents (LPAs) [79]. The most popular LPA is Didehydro-cortistatin A (dCA) and was reported to efficiently cross the BBB and significantly reduce HIV RNA levels in the brain of the bone marrow-liver-thymus (BLT) mouse model of HIV latency and persistence. In addition, dCA also decreased the uptake of HIV-1 transactivator of transcription (Tat) in microglia-like and astrocyte cell lines [81,82]. Considering Tat\u2019s pro-inflammatory and cytotoxic properties, inhibition of Tat activity in the CNS may alleviate Tat-mediated neurotoxicity and neuroinflammation [83].\n\nFinal thoughts and Concluding remarks\n\nIn this thesis, we advocate and provide supporting evidence for the CNS as a viral reservoir for HIV. In particular, microglia were identified as a major CNS target cell susceptible to HIV replication, CSF-derived viral clones were detected with an intermediate enhancement for entry into microglia, and in the CNS CD11b positive cells from a suppressed individual, we found intact proviral DNA whose envelope gene was capable of replication.\n\nThus, the major question is \u201cDo we, in conjunction with current literature, now have sufficient evidence to permanently designate the CNS as an HIV reservoir? \u201cSimply put, no. We have shown that CNS cells harbor intact HIV proviral DNA; however, if we strictly adhere to the criteria and requirements of an HIV reservoir, we still need definitive evidence that latently infected CNS cells can produce infectious virus upon reactivation and reseed peripheral viremia after ART is discontinued. To date, this criterion can only be addressed by performing a QVOA on the reservoir of interest. While performing the QVOA on human brain tissue is technically feasible, it involves a considerable number of practical challenges which include the difficulty of obtaining large amounts of brain tissue from well-characterized virally suppressed HIV-infected individuals and finding appropriate stimuli and target cells that can efficiently activate CNS cells and maintain the (macrophage-tropic) characteristics of the CNS viral population through sequential rounds of culture. Therefore, apart from the ethical issues, such a study would still take several years to complete. In the meantime, as cure strategies and HIV-1 intervention trials are quickly progressing (clinicaltrials.gov), we contend that the CNS should be regarded as an HIV reservoir, despite its unproven replication competence, and incorporated into current and new curative strategies.\n\nSubsequently, to incorporate the CNS in cure interventions, we need a comprehensive understanding of the molecular mechanisms responsible for the establishment and maintenance of HIV latency in the infected CNS cells. In this thesis, we propose that microglia are the predominant cellular HIV reservoir in the CNS and characterized several human microglial culture models. The question is: \u201cHow do we move forward with these models to advance neuroHIV research?\u201d. In chapters 2 and 5, cerebral organoids are highlighted as the most representative CNS culture model for the recapitulation of HIV infection in the CNS in vivo. However, the cerebral organoid field is still in its infancy and requires additional optimization to increase reproducibility, as well as the consistent induction of microglial cells. The latter is especially vital for HIV research, as we and others have shown microglia to be the only cells susceptible to HIV infection within cerebral organoids. Thus, until we have a protocol that can reproducibly generate microglia-containing organoids, this model is not yet suitable for wide-scale HIV research.\n\nAn alternative model would be iPSC-derived tri-culture models of microglia, astrocytes, and neurons, in which the prevalence rate of each cell type can be readily manipulated. This model could be used to further investigate the inhibitory role of surrounding CNS cells on HIV infection of microglia, observed in the cerebral organoids. Furthermore, one of the main research questions for the CNS reservoir is to determine if and how HIV latency in the CNS cells differs from the CD4+ T cells. Using the iPSC-derived tri-culture model or primary microglia we can assess the integration site of HIV, identify epigenetic modulators of transcription that can be used for LRAs and LPAs, and also elucidate the efficacy and toxicity of current LRAs, LPAs, and the CRISPR\/Cas9 system. In addition, the iPSC-derived tri-culture model can also be used to study HIV-induced neuronal damage and neuroinflammation responsible for the development of HAND. Lastly, primary microglia and monocyte-derived microglia can be used to assess the replication-competence and macrophage tropism of HIV variants isolated from the CSF and brain tissue. Primary microglia and monocyte-derived microglia can also be used in the QVOA as target cells for the propagation of the viruses, following ex vivo stimulation.\n\nThe final question is: which cure strategy should we use for the CNS reservoir and how should we monitor this reservoir in cure inventions? The main goal of targeting the CNS reservoir will be to select a carefully tailored combination of two or more strategies that can eradicate, or permanently block, the replication-competent viral reservoir in the CNS while preventing permanent neurological damage.\n\nCurrently, the most popular approach is the shock and kill, however, implementing this approach without having proper knowledge of the CNS reservoir and the efficacy of killing, carries a great deal of risk. In contrast, the block and lock strategy or the use of CRISPR to excise proviral DNA or block gene transcription is much more neurologically safe, in terms of bypassing cell activation and HIV production. Although it remains to be studied how much of the reservoir needs to be blocked or eradicated to prevent rebound viremia, as none of these methods are likely to be capable of targeting all latently infected cells. A case in point is the Boston patients, who despite having an undetectable viral load in their blood and peripheral tissues, faced HIV reactivation and viral rebound suggesting that HIV cure most likely requires complete eradication or blocking of de novo infections. Furthermore, while the defective reservoir is not considered part of the HIV reservoir due to its replication incompetence, defective proviruses have been repeatedly reported to express HIV RNA transcripts and proteins that have not only been found to play a role in the development of neuropathogenesis but are also hypothesized to function as a decoy by distracting immune cells from targeting the intact reservoir. Taking this into consideration, the prevalence of a transcriptionally active defective reservoir, after the eradication of the intact reservoir, could still cause serious neurological complications among the HIV-infected population.\n\nUnfortunately, determining the degree of depletion or eradication of the CNS reservoir in living subjects is not possible due to the ethical restriction of pre-mortem brain biopsies. Consequently, the examination of CSF will remain the best resource for assessing HIV in the brain. CNS HIV monitoring should include serial sampling of paired CSF and plasma, before, during, and after a cure intervention [84]. Several CSF markers have been reported that can be used to monitor CNS immune activation, inflammation, and neuronal injury including neopterin [85], neurofilament light chain [86], YKL-40 [87,88], and Trem2 [89]. Measurement of these CSF markers during the intervention would give insight into the state of microglia activation, neuroinflammation, and possible neuronal damage. However, since lumbar puncture is an invasive procedure and uncomfortable for the patient, more research is needed on the development of blood biomarkers to monitor HIV activity in the CNS [90]. In HIV cure-directed clinical trials using analytical treatment interruptions (ATIs), CSF viral rebound should be phylogenetically characterized together with plasma rebound viruses to investigate CNS compartmentalization. Finally, after ART resumption, CSF viremia and inflammation must be monitored to ensure a return to baseline values and a clinical neurological examination or neuropsychological testing should be conducted to determine whether any neurological impairment occurred [84].","auteur":"Stephanie Gumbs","auteur_slug":"stephanie-gumbs","publicatiedatum":"16 februari 2023","taal":"NL","url_flipbook":"https:\/\/ebook.proefschriftmaken.nl\/ebook\/stephaniegumbs?iframe=true","url_download_pdf":"","url_epub":"","ordernummer":"FTP-202604100821","isbn":"978-94-6469-213-6","doi_nummer":"","naam_universiteit":"Universiteit Utrecht","afbeeldingen":12408,"naam_student:":"","binnenwerk":"","universiteit":"Universiteit Utrecht","cover":"","afwerking":"","cover_afwerking":"","design":""},"_links":{"self":[{"href":"https:\/\/www.proefschriftmaken.nl\/en\/wp-json\/wp\/v2\/us_portfolio\/10849","targetHints":{"allow":["GET"]}}],"collection":[{"href":"https:\/\/www.proefschriftmaken.nl\/en\/wp-json\/wp\/v2\/us_portfolio"}],"about":[{"href":"https:\/\/www.proefschriftmaken.nl\/en\/wp-json\/wp\/v2\/types\/us_portfolio"}],"author":[{"embeddable":true,"href":"https:\/\/www.proefschriftmaken.nl\/en\/wp-json\/wp\/v2\/users\/8"}],"replies":[{"embeddable":true,"href":"https:\/\/www.proefschriftmaken.nl\/en\/wp-json\/wp\/v2\/comments?post=10849"}],"version-history":[{"count":1,"href":"https:\/\/www.proefschriftmaken.nl\/en\/wp-json\/wp\/v2\/us_portfolio\/10849\/revisions"}],"predecessor-version":[{"id":10852,"href":"https:\/\/www.proefschriftmaken.nl\/en\/wp-json\/wp\/v2\/us_portfolio\/10849\/revisions\/10852"}],"wp:featuredmedia":[{"embeddable":true,"href":"https:\/\/www.proefschriftmaken.nl\/en\/wp-json\/wp\/v2\/media\/12408"}],"wp:attachment":[{"href":"https:\/\/www.proefschriftmaken.nl\/en\/wp-json\/wp\/v2\/media?parent=10849"}],"wp:term":[{"taxonomy":"us_portfolio_category","embeddable":true,"href":"https:\/\/www.proefschriftmaken.nl\/en\/wp-json\/wp\/v2\/us_portfolio_category?post=10849"}],"curies":[{"name":"wp","href":"https:\/\/api.w.org\/{rel}","templated":true}]}}