{"id":10039,"date":"2026-04-08T14:55:49","date_gmt":"2026-04-08T14:55:49","guid":{"rendered":"https:\/\/www.proefschriftmaken.nl\/portfolio\/raimond-heukers\/"},"modified":"2026-04-23T07:46:40","modified_gmt":"2026-04-23T07:46:40","slug":"raimond-heukers","status":"publish","type":"us_portfolio","link":"https:\/\/www.proefschriftmaken.nl\/en\/portfolio\/raimond-heukers\/","title":{"rendered":"Raimond Heukers"},"content":{"rendered":"","protected":false},"excerpt":{"rendered":"","protected":false},"author":8,"featured_media":12930,"comment_status":"closed","ping_status":"closed","template":"","meta":{"_acf_changed":false,"footnotes":""},"us_portfolio_category":[45],"class_list":["post-10039","us_portfolio","type-us_portfolio","status-publish","has-post-thumbnail","hentry","us_portfolio_category-new-template"],"acf":{"naam_van_het_proefschift":"Clustering-Induced, Clathrin-Mediated Endocytosis (CIC-ME) for Cancer Therapy","samenvatting":"Kanker wordt gekenmerkt door ongecontroleerde groei en deling van cellen. Kankercellen zijn in staat zichzelf te voorzien van groeisignalen en\/of kunnen zich onbeperkt repliceren. Naast chirurgie, bestraling en chemotherapie kan een anti-kanker behandeling ook bestaan uit therapie\u00ebn die zich richten tegen specifieke tumor-gerelateerde moleculen. Voorbeelden hiervan zijn small molecule inhibitors, siRNAs en immunotherapie. De laatstgenoemde aanpak maakt gebruik van antilichamen die het immuunsysteem activeren of specifieke tumor-gerelateerde signaleringspaden blokkeren. Helaas wordt de tumorgroei vaak alleen geremd door de antilichamen en wordt de tumor niet volledig verwijderd. De specifieke anti-kanker activiteit kan verbeterd worden door de tumor-specificiteit van antilichamen te combineren met de toxiciteit van een therapeutisch middel. Deze antilichaam-geneesmiddel conjugaties (antibody-drug conjugates, ADC) verhogen de effectiviteit van antilichamen waardoor de kans op bijwerkingen van de chemotherapie wordt verminderd.\n\nVoor een optimale ophoping en verdeling van zulke ADCs in de tumor zijn de specificiteit, bindingsaffiniteit, en de grootte van het antilichaam belangrijk. Conventionele antilichamen zijn relatief groot, wat leidt tot een relatief slechte tumorpenetratie en distributie. Daarom zijn er in de laatste decennia verschillende soorten kleinere antilichaamfragmenten ontwikkeld. Een voorbeeld hiervan is het variabele domein van de zware-keten-antilichamen van lama\u2019s (VHH of nanobody). Een overzicht van het gebruik van nanobodies bij anti-kanker therapie wordt gegeven in Hoofdstuk 2. Nanobodies die gebruikt worden voor het bezorgen van therapeutische moleculen worden \u2018Nanobullets\u2018 genoemd. Omdat vele therapeutische, en in dit geval toxische moleculen intracellulair functioneren, binden ideale Nanobullets niet alleen aan tumorcellen, maar regelen ze ook de intracellulaire afgifte van het therapeutisch molecuul. Voor het ontwikkelen van een Nanobullet met een effici\u00ebnte intracellulaire afgifte, is een gedegen kennis van de biologie van cellulaire opname essentieel.\n\nDe epidermale groei factor receptor (EGFR) en de hepatocyte groei factor (HGF) receptor (Met) zijn tumor-gerelateerde, celmembraan gebonden receptor tyrosine kinases en daarom aantrekkelijke doelwitten voor therapie. EGFR dient al jaren als model receptor en de activatie en internalisatie van EGFR zijn goed bestudeerd. Ligand-ge\u00efnduceerde signalering van beide receptoren wordt geneutraliseerd door een negatieve-feedback mechanisme dat bestaat uit een snelle internalisatie en afbraak van het receptor-ligand complex. De internalisatie wordt gereguleerd door meerdere ligand-ge\u00efnduceerde post-translationele modificaties zoals fosforylering, ubiquitinering en acetylering. Deze modificaties verklaren de ligand-ge\u00efnduceerde internalisatie echter niet volledig. Sinds kort wordt er gesuggereerd dat de activatie-ge\u00efnduceerde clustering van EGFR op het plasmamembraan ook betrokken zou zijn bij internalisatie. Echter, het mechanisme van deze clustering-ge\u00efnduceerde internalisatie is nog onduidelijk.\n\nIn dit proefschrift wordt clustering-ge\u00efnduceerde internalisatie van EGFR en het mechanisme hierachter onderzocht met behulp van multi-epitoop-bindende antilichaam constructen gericht tegen het extracellulaire deel van EGFR (Hoofdstuk 3). EGFR clustering via biparatope VHHs (die twee niet-overlappende epitopen binden) resulteert in de internalisatie van het receptor-antilichaam complex via zogenaamde clustering-ge\u00efnduceerde, clathrine-gemedieerde endocytose (CIC-ME). CIC-ME is kinase-onafhankelijk en activeert de groei en proliferatieve signalering van tumor cellen niet. CIC-ME onthulde een voorheen onbekende rol van de transmembraan dimerisatie motieven van EGFR in internalisatie. EGFR clustering via tri-epitopische antilichaam-fibronectine constructen leidt vervolgens tot een onconventioneel, ubiquitine-onafhankelijk transport van EGFR richting lysosomale afbraak (Hoofdstuk 4).\n\nDe opgedane kennis omtrent kinase-onafhankelijke internalisatie en lysosomale transport in tumorcellen werd vervolgens toegepast bij de ontwikkeling van verschillende soorten internaliserende Nanobullets. Albumine nanodeeltjes werden gedecoreerd met nanobodies (NANAPs) voor de specifieke intracellulaire afgifte van de multi-kinase remmer 17864 in EGFR-positieve tumor cellen (Hoofdstuk 5). Lysosomale afgifte van 17864, door middel van een reversibele platinum-verbinding (Lx) tussen het albumine en 17864, zorgde voor remming van celdeling. Anti-Met NANAPs laten een soortgelijke internalisatie, lysosomaal transport en afbraak zien en kunnen beschouwd worden als een nieuw biomateriaal voor de intracellulaire afgifte van therapeutische moleculen in Met-positieve tumor cellen (Hoofdstuk 6). Ten slotte werden de nanobodies van de eerste internalisatie studies omgezet in Nanobullets voor fotodynamische therapie (PDT) door ze te koppelen aan de relatief hydrofiele photosensitizer (PS) IRDye700DX (Hoofdstuk 7). Na bestraling van deze PS met bijna infra-rood licht, vormt zich het zeer toxische NO2. Nanobody-PS-conjugaten laten een erg specifieke en hoge anti-tumor activiteit zien, die nog verder verbeterd wordt door internaliserende biparatope Nanobullets (100 % specifieke celdood met een IC50 van ~1 nM).\n\nSamengevat, dit proefschrift (I) beschrijft het gebruik van nanobodies voor de behandeling van kanker tot dusver, (II) geeft inzicht in de fundamentele biologie achter clustering-ge\u00efnduceerde opname en transport in tumor cellen en (III) geeft drie voorbeelden van potenti\u00eble Nanobullets voor de behandeling van kanker. Door hun kleine formaat, de hoge specificiteit en hoge anti-tumor activiteit, zijn internaliserende nanobody-PS conjugaten de meest veelbelovende voorbeelden van Nanobullets die daardoor erg interessant voor verdere in vivo testen.","summary":"Cancer is characterized by uncontrolled growth or proliferation of cells. Cancer cells have acquired self-sufficiency in growth signalling and\/or unlimited replication. Besides surgery or chemo- or radiation therapy, cancer therapies can focus on targeting specific tumor-related molecules. Examples of targeted therapies include small molecule inhibitors, small interfering RNAs (siRNA) and immunotherapy, the latter of which involves the use of antibodies that either activate the immune system or block tumor-related signalling cascades. Unfortunately, antibody treatments are often not sufficient to remove a tumor completely and more aggressive measures are welcome. A way to improve the specific anti-tumor activity is using so-called antibody-drug conjugates (ADC). Combining the tumor-specificity of an antibody with the cytotoxicity of a therapeutic agent enhances the potency of the antibody and reduces the off-target toxicity of chemotherapy.\n\nFor optimal tumor targeting and penetration, specificity, binding affinity and size of the targeting ligand matter. In that respect, conventional antibodies are relatively large and therefore display poor tumor penetration\/distribution. This is why several types of smaller antibody fragments or scaffold proteins have been developed in the last decades. An example of such a small antibody fragment is the variable domain of the heavy chain of heavy chain only antibodies (VHH or nanobody). An overview of the use of nanobodies for cancer-therapy is given in Chapter 2. Nanobodies that are being used for the delivery of therapeutic molecules can be referred to as so-called \u201cNanobullets\u201d. Because many therapeutic, and in this case cytotoxic compounds require an intracellular localization for their activity, ideal Nanobullets should not only target to tumor cells but should also facilitate intracellular delivery. In order to achieve an efficient intracellular delivery of Nanobullets, a basic understanding of the biology behind cellular uptake is essential.\n\nThe epidermal growth factor receptor (EGFR) and the hepatocyte growth factor (HGF) receptor (Met) are receptor tyrosine kinases that are overexpressed in many cancers, making them attractive targets for cancer therapy. EGFR serves as a model receptor and its activation and internalization are well studied. Ligand-induced signalling of both receptors is silenced by a negative-feedback mechanism consisting of rapid internalization and subsequent degradation of the receptor-ligand complex. Internalization of EGFR is regulated by many ligand-induced post-translational modifications like phosphorylation, ubiquitination and acetylation. However, these modifications do not explain the observed internalization completely. Because ligand-binding also results in the formation of higher order clusters of EGFR on the plasma membrane, clustering was recently suggested to be involved in receptor internalization also. However, the mechanism behind clustering-induced internalization is still unclear.\n\nIn this thesis, the mechanism behind clustering-induced endocytosis was studied using multi-epitopic antibody constructs directed against the extracellular part of EGFR (Chapter 3). EGFR clustering via biparatopic (binding two non-overlapping epitopes) VHH constructs results in the clustering-induced, clathrin mediated endocytosis (CIC-ME) of the receptor-antibody complex. CIC-ME is kinase-independent and therefore does not activate signalling cascades towards growth and proliferation. CIC-ME also revealed a previously unrecognized role for the transmembrane dimerization motifs of EGFR in internalization. Subsequently, EGFR clustering via tri-epitopic antibody-fibronectin constructs induces unconventional, ubiquitin-independent trafficking of EGFR towards lysosomal degradation (Chapter 4). The knowledge of achieving kinase-independent internalization into tumor cells was put to practice by developing different internalizing Nanobullets for intracellular drug delivery. Nanobody-decorated, albumin-based nanoparticles (NANAPs) were generated for the intracellular release of the platinum-linked multikinase inhibitor 17864-Lx in lysosomes of EGFR-expressing tumor cells (Chapter 5). Anti-Met NANAPs displayed similar internalization, lysosomal trafficking and degradation and could therefore serve as a novel biomaterial for drug delivery into Met-expressing cells (Chapter 6). Finally, nanobodies were turned into Nanobullets for photodynamic therapy (PDT) by conjugating them to the relatively hydrophilic photosensitizer IRDye700DX (Chapter 7). Illumination of such photosensitizers (PS) with near-infra red light locally generates the very toxic 1O2. The nanobody-PS conjugates display a specific and strong anti-tumor activity, which can be improved even further by employing internalizing, biparatopic Nanobullets (100% specific cell death, IC50 of ~1nM).\n\nTaken together, this thesis (I) describes the use of nanobodies for cancer therapy, (II) provides a fundamental background behind clustering-mediated uptake and trafficking in tumor cells and (III) gives three examples of nanobullets for cancer therapy. Because of their small size, high specificity and high potency, internalizing nanobody-PS conjugates are considered to be the most promising examples of Nanobullets, which clearly deserve further in vivo testing.","auteur":"Raimond Heukers","auteur_slug":"raimond-heukers","publicatiedatum":"20 januari 2014","taal":"EN","url_flipbook":"https:\/\/ebook.proefschriftmaken.nl\/ebook\/raimondheukers?iframe=true","url_download_pdf":"","url_epub":"","ordernummer":"FTP-202604081453","isbn":"978-90-393-6065-1","doi_nummer":"","naam_universiteit":"Universiteit Utrecht","afbeeldingen":12930,"naam_student:":"","binnenwerk":"","universiteit":"Universiteit Utrecht","cover":"","afwerking":"","cover_afwerking":"","design":""},"_links":{"self":[{"href":"https:\/\/www.proefschriftmaken.nl\/en\/wp-json\/wp\/v2\/us_portfolio\/10039","targetHints":{"allow":["GET"]}}],"collection":[{"href":"https:\/\/www.proefschriftmaken.nl\/en\/wp-json\/wp\/v2\/us_portfolio"}],"about":[{"href":"https:\/\/www.proefschriftmaken.nl\/en\/wp-json\/wp\/v2\/types\/us_portfolio"}],"author":[{"embeddable":true,"href":"https:\/\/www.proefschriftmaken.nl\/en\/wp-json\/wp\/v2\/users\/8"}],"replies":[{"embeddable":true,"href":"https:\/\/www.proefschriftmaken.nl\/en\/wp-json\/wp\/v2\/comments?post=10039"}],"version-history":[{"count":1,"href":"https:\/\/www.proefschriftmaken.nl\/en\/wp-json\/wp\/v2\/us_portfolio\/10039\/revisions"}],"predecessor-version":[{"id":10042,"href":"https:\/\/www.proefschriftmaken.nl\/en\/wp-json\/wp\/v2\/us_portfolio\/10039\/revisions\/10042"}],"wp:featuredmedia":[{"embeddable":true,"href":"https:\/\/www.proefschriftmaken.nl\/en\/wp-json\/wp\/v2\/media\/12930"}],"wp:attachment":[{"href":"https:\/\/www.proefschriftmaken.nl\/en\/wp-json\/wp\/v2\/media?parent=10039"}],"wp:term":[{"taxonomy":"us_portfolio_category","embeddable":true,"href":"https:\/\/www.proefschriftmaken.nl\/en\/wp-json\/wp\/v2\/us_portfolio_category?post=10039"}],"curies":[{"name":"wp","href":"https:\/\/api.w.org\/{rel}","templated":true}]}}